本发明专利技术属于酶基因工程及酶工程领域，涉及一种邻硝基苯甲醛降解酶、其编码基因及其应用。一种邻硝基苯甲醛降解酶(NbaA酶)，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。所述的邻硝基苯甲醛降解酶的编码基因(基因nbaA)，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明专利技术通过克隆Pseudomonas?sp.ONBA-17中负责ONBA降解的脱氢酶基因并表达，获得了ONBA降解酶，为ONBA的降解提供有效的生物降解手段，对于ONBA污染环境的修复具有重要意义。本发明专利技术得到的NbaA酶对ONBA的酶活力为2442U／mg，分别是NahF酶活力(552U／mg)和NahV酶活力(245U／mg)的442.4％和996.7％，显著强于二者。而nbaA同nahF和nabV的序列同源性分别为62％和89％。由上可知，基因序列的不同引发了酶的空间构象的差异，并最终致使酶作用能力产生差异。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于酶基因工程及酶工程领域，涉及一种邻硝基苯甲醛降解酶、其编码基因及其应用。一种邻硝基苯甲醛降解酶(NbaA酶)，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。所述的邻硝基苯甲醛降解酶的编码基因(基因nbaA)，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本专利技术通过克隆Pseudomonas?sp.ONBA-17中负责ONBA降解的脱氢酶基因并表达，获得了ONBA降解酶，为ONBA的降解提供有效的生物降解手段，对于ONBA污染环境的修复具有重要意义。本专利技术得到的NbaA酶对ONBA的酶活力为2442U／mg，分别是NahF酶活力(552U／mg)和NahV酶活力(245U／mg)的442.4％和996.7％，显著强于二者。而nbaA同nahF和nabV的序列同源性分别为62％和89％。由上可知，基因序列的不同引发了酶的空间构象的差异，并最终致使酶作用能力产生差异。【专利说明】邻硝基苯甲醛降解酶、其编码基因及其应用
本专利技术属于酶基因工程及酶工程领域，涉及一种邻硝基苯甲醛降解酶、其编码基因及其应用。
技术介绍
随着我国工业化进程的加快，有机工业合成废水的排放量越来越大。有机工业合成废水是指在生产过程中排放的含有对生物体有毒的工业废水，这类废水不仅含大量有机物，且存在大量对生物体有毒害作用的物质，已对环境造成了严重的污染，威胁到人类生命健康。参照急性毒性分级标准，邻硝基苯甲醛(o-nitoobenzaldehyde，0NBA)为中等毒性化合物。ONBA是重要的精细有机化工中间体，广泛用于医药、染料和有机合成，如用于合成抗心绞痛药物硝基吡啶(心痛定)、邻硝基苯乙烯类及邻硝基肉桂酸类系列产品等。将其硝基还原成氨基后，所得到的邻氨基苯甲醛还可用于喹啉类化合物的合成，其工业需求量十分大。但由于其生产过程伴随着大量污染物质的产生，发达国家已将其生产线转移到发展中国家(污染转移)，这一点在我国东南部地区尤为明显。具不完全统计，东南地区年产邻硝基苯甲醛在70万吨以上，且绝大多数生产废水未经处理就直接排放，对周边环境造成了极大的损害。在一定程度上，可以说这一点源污染已成为面源污染。目前，关于ONBA降解酶编码基因及其应用的报道极为有限。在赵化冰等人的研究中(赵化冰，李永君，陈威，蔡宝立.恶臭假单胞菌ND6菌株中与萘降解相关的新型水杨醛脱氢酶NahV.科学通报，2007，52:1257-1262)，他们获得了与ONBA降解相关的新型水杨醛脱氢酶NahV及其编码基因，并将其同NahF进行了比较。然而，无论是nahV基因，还是nahF基因，其编码蛋白酶活力均较为有限，且NahV酶活力在较高温度(如:50°C )会很快丧失。因而，寻找能够编码更高ONBA代谢酶活力并具备热稳定性蛋白的功能基因就显得十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种邻硝基苯甲醛降解酶(NbaA酶)。本专利技术的另一目的是提供该邻硝基苯甲醛降解酶的编码基因(基因nbaA)。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是:一种邻硝基苯甲醛降解酶(NbaA酶)，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述的邻硝基苯甲醛降解酶的编码基因(基因nbaA)，其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。所述的邻硝基苯甲醛降解酶在降解邻硝基苯甲醛中的应用。作为优选，应用所述邻硝基苯甲醛降解酶降解邻硝基苯甲醛时，温度为18-40°C，pH 为 6.0-8.5。扩增所述的邻硝基苯甲醛降解酶的编码基因的引物，其核苷酸序列分别为SEQ IDN0.3 和 SEQ ID N0.4。 含有本专利技术所述基因的重组载体。含有本专利技术所述基因的重组菌。含有以上任一所述基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本专利技术的保护范围。本专利技术通过克隆Pseudomonas sp.0NBA-17中负责ONBA降解的脱氢酶基因并表达，获得了 ONBA降解酶，为ONBA的降解提供有效的生物降解手段，对于ONBA污染环境的修复具有重要意义。该菌是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的菌株0NBA-17,于2013年9月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC N0.8095。保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，该菌的分类命名为假单胞菌 Pseudomonas sp.。本专利技术得到的NbaA酶对ONBA的酶活力为2442U / mg,分别是NahF酶活力(552U / mg)和 NahV 酶活力(245U / mg)的 442.4%和 996.7%，显著强于二者。而 nbaA同nahF和nahV的序列同源性分别为62%和89%。由上可知，基因序列的不同引发了酶的空间构象的差异，并最终致使酶作用能力产生差异。【专利附图】【附图说明】图1 是 Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA(Genomic DNA)电泳检测图。图2是不同处理土壤样品中ONBA含量变化曲线。【具体实施方式】下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本专利技术的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本专利技术保护范围。在本专利技术中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。实施例1Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA (Genomic DNA)的提取1.1Pseudomonas sp.0NBA-17 的扩大培养在无菌操作环境下，将_70°C保存的Pseudomonas sp.0NBA-17以接种针挑取小块，放置、涂布于Luria-Bertani(LB)固体培养基之上。28°C，静置培养3d。挑选单菌落，经2次转接，观察发现平板上菌落形态一致(无杂菌)。这里所述的“平板”和Luria-Bertani (LB)固体/液体培养基等均为微生物研究/生产领域常见术语、培养基、技术和方法，具体参见《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，等著.分子克隆实验指南(第三版).黄培堂，等译.北京:科学出版社，2008)。下文中如无特别备注或说明，均为微生物研究常用技术、方法、培养基、试剂和药品，且均在《分子克隆实验指南》中有所记录。1.2Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA 的提取菌体总DNA的提取采用SDS高盐沉淀法。挑取LB平板上的单菌落，接至IOOmL的LB液体培养基培养至稳定期。离心收集菌体，加等体积的TEN溶液洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于IOmL TE溶液中，加入 100 y L 溶菌酶(IOOmg / mL)，37°C水浴lh，加入 40ii L 蛋白酶 K(20mg / mL)，再加入 300 y L20% (w / v% )的 SDS，37°C水浴过夜(约12h)。加入I / 2体积饱和NaCl剧烈振荡，12000g离心20min，上清用等体积酚:氯仿抽提2次，12000g离心lOmin，收集上清，加入等体积TE溶液(稀释调整NaCl浓度)，0.6倍体积异丙醇沉淀，12000g离心15min，70% (v / v% )乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后溶于 100μ L TE 中。将提取到的菌体总DNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种邻硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：虞方伯，单胜道，管莉菠，骆林平，叶正钱，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：
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