一种提高酶热稳定性的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高酶热稳定性的方法，使用ProTherm数据库中的数据对6种蛋白质预测软件进行评测，以敏感度和准确度为评测标准，筛选出敏感度大于第一阈值，同时准确度大于第二阈值的软件，并获取各评测合格软件相对应的合格能量阈值范围；然后对酶运行筛选出的各评测合格软件，分别获得满足所述各评测合格软件相对应的合格能量差异阈值范围的突变点，取各评测合格软件获得的突变点的交集，再排除影响酶的催化能力的突变点，获得最终突变点；构建酶突变菌株，测定其热稳定性，获得热稳定性提高的突变体。

A method to improve the thermal stability of enzymes

The invention discloses a method to improve the thermal stability of the enzyme. Using the data in the ProTherm database to evaluate 6 kinds of protein prediction software, the sensitivity and accuracy are used as the evaluation criteria, and the soft parts which are more sensitive than the first threshold and the accuracy is greater than second threshold are screened, and the relative evaluation software is obtained. The range of qualified energy threshold should be selected; then each of the qualified software selected for the enzyme operation is obtained to obtain the mutation points that meet the range of the qualified energy difference threshold, which correspond to the qualified software of the evaluation, and take the intersection of the mutation points obtained by the qualified software, and then remove the mutation point of the catalytic activity of the rlout. Finally, mutants were constructed, and the thermal stability of the mutant was determined, and the mutant with improved thermal stability was obtained.

【技术实现步骤摘要】
一种提高酶热稳定性的方法
本专利技术属于酶工程
，更具体地，涉及一种提高酶热稳定性的方法。
技术介绍
酶是已知最有效的催化化学反应的催化剂，可将反应速度提高多达23个数量级。代谢工程与工业生物催化剂日益需要酶的蛋白质工程提供所需催化特性，例如区域选择性和立体选择性，从而提高产率以及降低副产物带来的损失。酶的最适温度普遍在40℃左右，而工业应用中常常会需要或遇到高于45℃的高温环境，高温使酶发生不可逆的失活，阻碍了其应用范围。提高脂肪酶的热稳定性，可通过对酶进行化学修饰或分子改造而实现。与传统的突变筛选相比，近年来飞速发展的计算机辅助设计对于改造酶热稳定性产生了更加巨大的积极作用。蛋白质热稳定性预测软件通过不同算法，分别对原始蛋白和突变蛋白进行ΔG的计算，得出二者的差异ΔΔG，可以大幅减少实验筛选带来的人力物力消耗。现有蛋白质热稳定性预测软件预测结果中，敏感度(即能够从所有突变点中识别出真实提高热稳定性的突变点)越高，假阳性(预测提高热稳定性,实际却无效果)突变体越多，准确度(真实提高突变点占预测提高突变点的比例)就会下降，这样在后续验证实验中就会增加无效的工作量；而准确度越高，假阳性突变点越少，相应可识别出的真实提高热稳定性突变点越少，遗漏真实提高突变点越多。目前，需要一种尽可能同时保证准确度和敏感度的预测方法。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种提高酶热稳定性的方法，其目的在于组合多种技术手段，令敏感度和准确度达到相对平衡，通过较少的验证实验，得到明显提高热稳定性突变体。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种提高酶热稳定性的方法，包括如下步骤：(1)使用ProTherm数据库中的数据对CUPSAT,I-Mutant3.0,SDM,ELASPIC,FoldX,Rosettaddg_monomer6种蛋白质预测软件进行评测，以敏感度和准确度为评测标准，筛选出敏感度大于第一阈值，同时准确度大于第二阈值的软件，其为评测合格软件，并获取各评测合格软件相对应的合格能量阈值范围；其中，所述第一阈值为40％,所述第二阈值为60％；(2)对酶运行步骤(1)筛选出的各评测合格软件，分别获得满足所述各评测合格软件相对应的合格能量差异阈值范围的突变点，取各评测合格软件获得的突变点的交集，即为该酶的热稳定性提高的突变点集合；(3)排除步骤(2)所述突变点集合中影响酶的催化能力的突变点，获得最终突变点；(4)根据步骤(3)获得的最终突变点或其组合构建酶突变菌株，测定其热稳定性，获得热稳定性提高的突变体。优选地，步骤(1)所述评测方法具体包括如下步骤：(1-1)选取ProTherm数据库中的蛋白质及其热稳定性突变点数据组成评测数据集；(1-2)设定所述六种软件的ΔΔG判断热稳定性的能量阈值范围，按照不稳定到稳定的顺序从左到右排列，对于CUPSAT,I-Mutant3.0和SDM软件，设置(-1.5，+∞)，(-1.0，+∞)，(-0.5，+∞)，(0，+∞)，(0.5，+∞)，(1.0，+∞)，(1.5，+∞)7个能量阈值范围；对于FoldX,Rosettaddg_monomer和ELASPIC软件，设置(-∞，1.5)，(-∞，1.0)，(-∞，0.5)，(-∞，0)，(-∞，-0.5)，(-∞，-1)，(-∞，-1.5)7个能量阈值范围；(1-3)使用所述六种软件分别计算评测数据集中的突变点的ΔΔG值，获得每种软件对每个突变点热稳定性判断的预测值，统计所述预测值分别满足所述7个能量阈值范围的突变点个数；(1-4)筛选出敏感度大于第一阈值，同时准确度大于第二阈值的软件，其为评测合格软件，其对应的能量阈值范围即为各评测合格软件相对应的合格能量阈值范围。优选地，所述准确度定义为满足所述能量阈值范围的预测值中真实提高热稳定性突变点的个数占满足该范围所有预测值对应的突变点的个数的比例，所述敏感度定义为满足所述能量阈值范围的预测值中真实提高热稳定性突变点的个数占全部真实提高突变点的个数的比例。优选地，步骤(1-1)选取ProTherm数据库中10种最常见的蛋白质和11种在pH＝7中性条件下测定ΔΔG的蛋白质的热稳定性突变点组成评测数据集。优选地，步骤(1)所述敏感度大于第一阈值，同时准确度大于第二阈值的软件有3种，其分别为I-Mutant3.0，FoldX和Rosettaddg_monomer，其中所述软件I-Mutant3.0对应的合格能量阈值范围为(0，+∞),所述FoldX对应的合格能量阈值范围为(-∞，-0.5)，所述Rosettaddg_monomer对应的合格能量阈值范围为(-∞，-1)。优选地，步骤(2)所述运行步骤(1)筛选出的各软件的顺序为：先运行软件FoldX或Rosettaddg_monomer，最后运行软件I-Mutant3.0。优选地，步骤(3)所述影响酶的催化能力的突变点包括：1)距离催化位点以及底物结合位点氨基酸阈值以内的突变点，所述位点阈值为2)位于保守区域内的突变点；3)对酶结构具有重要作用位置的突变点。优选地，所述位于保守区域内的突变点的获得方法为：与所述酶同源性>80％的序列进行比对，找出所述酶序列的保守区域，获得位于保守区域内的突变点。优选地，所述对酶结构具有重要作用位置的突变点的获得方法为：对所述酶三维结构进行分析，通过测定特定基团之间的距离，得出蛋白质内部疏水相互作用，二硫键、氢键以及离子相互作用，获得对酶结构具有重要作用位置的突变点。优选地，步骤(4)具体包括以下步骤：(4-1)将所述最终突变点引入目标蛋白质的基因中，测序验证准确后，将其转入表达载体进行表达，得到单点突变的蛋白质；(4-2)使用Ni-NTA方法对所述单点突变的蛋白质进行纯化，使用超滤离心管对蛋白进行浓缩，再经透析得到所需测定的蛋白溶液；(4-3)将蛋白溶液与荧光染料进行混合，使用荧光定量PCR仪测定熔融曲线，得到各个单点突变的蛋白质的Tm值；(4-4)选取Tm值提高幅度大的突变点进行组合突变，按照(4.1)(4.2)(4.3)方法测定组合突变的Tm值，得到Tm值提高幅度最大的突变体。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，通过平衡准确度和敏感度，得到最优的三种蛋白质热稳定性预测软件及其能量阈值；通过这三种蛋白质热稳定性设计软件相结合，互相印证结果的同时可以大幅减少需要实验验证的突变点；再与催化位点分析、蛋白质序列、结构分析软件相结合，可以排除对脂肪酶结构具有重要作用的相关突变，使在提高热稳定性的同时对脂肪酶催化活力没有较大影响；是一种高效的提高脂肪酶热稳定性的方法。通过米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucormieheilipase,RML)突变菌株的热稳定性实验来验证突变残基，最终实现米黑根毛霉脂肪酶热稳定性的显著提高，通过本专利技术的方法得到的突变菌T18KT22IE230I，其Tm值为68℃，比亲本脂肪酶提高了9.5℃，在65℃下保温2小时后的相对残余酶活是原始菌RML的7.79倍。附图说明图1是本专利技术中提高米黑根毛霉脂肪酶热稳定性方法的示意图；图2是本专利技术中RML与部分单点突变以及组合突变Tm值测定结果；图3是本专利技术中RML与T18KT22I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高酶热稳定性的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用ProTherm数据库中的数据对CUPSAT,I‑Mutant 3.0,SDM,ELASPIC,FoldX,Rosetta ddg_monomer 6种蛋白质热稳定性预测软件进行评测，以敏感度和准确度为评测标准，筛选出敏感度大于第一阈值，同时准确度大于第二阈值的软件，其为评测合格软件，并获取各评测合格软件相对应的合格能量阈值范围；其中，所述第一阈值为40％,所述第二阈值为60％；(2)对酶运行步骤(1)筛选出的各评测合格软件，分别获得满足所述各评测合格软件相对应的合格能量差异阈值范围的突变点，取各评测合格软件获得的突变点的交集，即为该酶的热稳定性提高的突变点集合；(3)排除步骤(2)所述突变点集合中影响酶的催化能力的突变点，获得最终突变点；(4)根据步骤(3)获得的最终突变点或其组合构建酶突变菌株，测定其热稳定性，获得热稳定性提高的突变体。

【技术特征摘要】
1.一种提高酶热稳定性的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用ProTherm数据库中的数据对CUPSAT,I-Mutant3.0,SDM,ELASPIC,FoldX,Rosettaddg_monomer6种蛋白质热稳定性预测软件进行评测，以敏感度和准确度为评测标准，筛选出敏感度大于第一阈值，同时准确度大于第二阈值的软件，其为评测合格软件，并获取各评测合格软件相对应的合格能量阈值范围；其中，所述第一阈值为40％,所述第二阈值为60％；(2)对酶运行步骤(1)筛选出的各评测合格软件，分别获得满足所述各评测合格软件相对应的合格能量差异阈值范围的突变点，取各评测合格软件获得的突变点的交集，即为该酶的热稳定性提高的突变点集合；(3)排除步骤(2)所述突变点集合中影响酶的催化能力的突变点，获得最终突变点；(4)根据步骤(3)获得的最终突变点或其组合构建酶突变菌株，测定其热稳定性，获得热稳定性提高的突变体。2.如权利要求1所述的提高酶热稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)所述评测方法具体包括如下步骤：(1-1)选取ProTherm数据库中的蛋白质及其热稳定性突变点数据组成评测数据集；(1-2)设定所述六种软件的ΔΔG判断热稳定性的能量阈值范围，按照不稳定到稳定的顺序从左到右排列，对于CUPSAT,I-Mutant3.0和SDM软件，设置(-1.5，+∞)，(-1.0，+∞)，(-0.5，+∞)，(0，+∞)，(0.5，+∞)，(1.0，+∞)，(1.5，+∞)7个能量阈值范围；对于FoldX,Rosettaddg_monomer和ELASPIC软件，设置(-∞，1.5)，(-∞，1.0)，(-∞，0.5)，(-∞，0)，(-∞，-0.5)，(-∞，-1)，(-∞，-1.5)7个能量阈值范围；(1-3)使用所述六种软件分别预测所述评测数据集中的突变点的ΔΔG值，获得每种软件对每个突变点热稳定性判断的预测值，统计所述预测值分别满足所述7个能量阈值范围的突变点个数；(1-4)筛选出敏感度大于第一阈值，同时准确度大于第二阈值的软件，其为评测合格软件，其对应的能量阈值范围即为各评测合格软件相对应的合格能量阈值范围。3.如权利要求1或2所述的提高酶热稳定性的方法，其特征在于，所述准确度定义为满足所述能量阈值范围的预测值中真实提高热稳定性突变点的个数占满足该范围所有预测值对应的突变点的个数的比例，所述敏感度定义为满足所述能量阈值范围的预测值中真实提高热稳定性突变点的个数占全部真实提高突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫云君，李冠霖，苏枫，陈苑，方兴容，徐莉，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42