一种高通量的光电化学酪氨酸酶传感器制造技术

酪氨酸酶催化氧化酚类化合物产生的醌类化合物可以通过醌氨反应共价键合到沉积了壳聚糖的PbS量子点修饰的光电极表面，这些醌类化合物作为电子受体大大抑制了PbS量子点的光生电子‑空穴的复合，从而使阴极光电流大大提高。利用这一原理构建了针对酪氨酸酶活性检测的光电化学酶传感器。此传感器不仅具备光电阴极的高选择性，同时，也具有无需将酶固定、高通量、高灵敏的优势。为阴极光电化学酶传感器的研制提供了新策略。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量的光电化学酪氨酸酶传感器
：本专利技术涉及纳米分析检测领域，尤其涉及光电阴极在高通量酪氨酸酶传感器方面的应用。
技术介绍
：建立简便、灵敏地基于酶催化反应的传感器一直是分析检测领域的一个重要研究内容。基于酶反应的高效、温和与特异性，酶传感器在酶的活性检测、酶反应的底物/抑制剂的检测，以及尤其重要的是，在很多生物亲和反应(如DNA杂交、免疫反应、核酸适配体-蛋白质识别反应等)为基础的生物分析方面[CréminonC,TaranF.Chem.Commun.2015,51:7996-8009.]具有广泛的应用。因此，酶传感器在基础科学研究和临床诊断方面具有很重要意义。光电化学(PEC)作为一种新型的分析方法，具有设备简单、价格低廉、灵敏度高和易于微型化、快速化的特点，受到了越来越多的关注[Zhao,W.W.；Xu,J.J.；Chen,H.Y.Chem.Rev.2014,114:7421-7441；Zhao,W.W.；Xu,J.J.；Chen,H.Y.Chem.Soc.Rev.2015,44:729-741；Devadoss,A.；Sudhagar,P.；Terashima,C.；Nakata,K.；Fujishima,A.J.Photoch.Photobio.C2015,24:43-63.]。目前，大多数PEC酶传感器是基于光电极表面修饰的光电化学活性物质和固定在电极表面的酶的生物催化反应中涉及的反应物/产物发生光电化学反应导致的光电流信号的改变而实现测定的。基于n型半导体材料形成的光电阳极和多种酶反应(例如，辣根过氧化物酶[Chen,D.；Zhang,H.；Li,X.；Li,J.H.Anal.Chem.2010,82,2253-2261.]，葡萄糖氧化酶[Tanne,J.；D.；Khalid,W.；Parak,W.J.；Lisdat,F.Anal.Chem.2011,83,7778-7785.]，碱性磷酸酶[Zhao,W.W.；Ma,Z.Y.；Xu,J.J.；Chen,H.Y.Anal.Chem.2013,85,8503-8506.]，β-半乳糖苷酶[Zhao,W.W.；Chen,R.；Dai,P.P.；Li,X.X.；Xu,J.J.；Chen,H.Y.Anal.Chem.2014,86,11513-11516.]，乙酰胆碱酯酶[Zhuang,J.Y.；Tang,D.Y.；Lai,W.Q.；Xu,M.D.；Tang,D.P.Anal.Chem.2015,87,9473-9480.])的相互作用实现了对多种目标物的分析检测。然而，这些传统的PEC酶传感器通常是将天然酶固定在电极表面进行检测的，其存在一些缺陷：①酶经由静电吸附、共价结合、包埋和交联等方法固定在电极表面的过程中可能会导致酶活性的降低/丧失；②酶作为生物大分子固定在电极表面后，产生较大的空间位阻，一定程度上会抑制信号物质(即酶反应过程中涉及的反应物/产物)与电极表面的光电活性材料的接触，从而会降低传感器的灵敏度；③酶固定在电极表面导致了光电分析时在一段时间内要么进行生物反应要么进行光电化学检测，不利于实现高通量检测。因此发展不需要将酶固定在电极表面的高通量PEC检测方法很有必要。相对于PEC检测中应用广泛的n型半导体材料来说，我们首次将p型半导体材料运用到PEC的检测中(Wang,G.L.；Liu,K.L.；Dong,Y.M.；Wu,X.M.；Li,Z.J.；Zhang,C.Biosens.Bioelectron.2014,62:66-72.)。p型半导体材料的引入扩展了PEC在生物检测领域的应用。p型半导体材料作为阴极光电材料避免了电解质溶液中还原性物质与电极表面的空穴发生氧化反应，在生物检测领域具有较好的抗干扰能力[Wang,G.L.；Shu,J.X.；Dong,Y.M.；Wu,X.M.；Zhao,W.W.；Xu,J.J.；Chen,H.Y.Anal.Chem.2015,87:2892-2900；Wang,G.L.；Liu,K.L.；Shu,J.X.；Gu,T.T.；Wu,X.M.；Dong,Y.M；Li,Z.J.Biosens.Bioelectron.2015,69:106-112；Wang,G.L.；Liu,K.L.；Dong,Y.M.；Wu,X.M.；Li,Z.J.；Zhang,C.Biosens.Bioelectron.2014,62:66-72.]。遗憾的是，迄今为止，仅仅有一篇基于光电阴极的酶传感器的报道：该文献利用葡萄糖氧化酶催化反应消耗氧气引起NiO/CdS光电阴极电流的减小进行检测。然而，相对于增强型的生物传感器，此猝灭型的生物传感器的灵敏度和选择性不是特别令人满意。此外，如何实现不需要将酶固定在光电极表面的信号增强型、高通量检测仍然具有很大的挑战。本文报道了一种分离型的、高通量、信号增强型阴极光电化学酶传感器，以酪氨酸酶为典型的氧化还原酶实例，检验了该方法的效果。酪氨酸酶催化氧化酚类底物产生苯醌类化合物；作为电子受体的苯醌类化合物通过醌-氨反应形成的共价键直接结合到壳聚糖修饰的PbS光电阴极表面，使光电流大大增强。结果证明，该方法对酪氨酸酶具有高灵敏的响应。此专利技术建立的分离式光电化学检测具有步骤简单、操作方便(不需要将酶固定)、灵敏度高、选择性好和高通量的特点。鉴于许多涉及酶催化的生物反应体系例如漆酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、辅酶Q等均涉及苯醌类物质作为反应物/产物，因此该检测体系非常有希望拓展为多种酶体系的检测以及酶联免疫反应涉及的生物亲和反应检测方面，实现对多种目标物的测定。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种高通量、多功能的阴极光电化学酪氨酸酶测定方法；尤其是通过醌氨反应策略实现了酶反应和光电化学检测的分离，提高了检测的灵敏度和选择性，同时也实现了高通量检测。本专利技术的目的可通过如下技术措施来实现：a、以巯基乙酸作为表面修饰剂制备水溶性PbS量子点，具体步骤为：将一定体积的巯基乙酸和25mL4.0mmol/L的Pb(CH3COO)2溶液搅拌混合后，用1mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH为8.0；然后将反应溶液除氧30min，之后加入2.0mL浓度为0.02mol/L的Na2S水溶液，在一定温度下除氧反应一段时间，得水溶性PbS量子点；b、将PbS量子点与壳聚糖依次修饰到电极表面：将预处理的ITO玻璃片浸在含有NaCl的2％PDDA聚合物的溶液中，10min后洗净；然后再浸入到水溶性PbS量子点溶液中，30分钟后取出洗净；用pH＝4.0的醋酸缓冲配制2wt％质量浓度的壳聚糖溶液，之后用pH＝7.0的醋酸缓冲液稀释成0.5wt％的浓度；吸取20uL稀释后的壳聚糖溶液滴加到PbS量子点电极上，在室温下干燥，备用；c、酪氨酸酶活性的测定：在96微孔板中，将20μL不同浓度的酪氨酸酶、20μL1mmol/L的酪氨酸酶底物和160μL浓度为0.1mol/L的pH＝7.0磷酸盐缓冲溶液混合，37℃下震荡反应90min；随后，将制备好的沉积了PbS以及壳聚糖的光电极浸没在上述反应后的溶液中，10min后取出洗涤，将电极放在盛有除氧后的0.1mol/L的pH＝7.0Tris-HCl缓冲溶液中进行光电化学检测。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量的光电化学酪氨酸酶传感器，其特征在于：a、以巯基乙酸作为表面修饰剂制备水溶性PbS量子点，具体步骤为：将一定体积的巯基乙酸和25mL4.0mmol/L的Pb(CH3COO)2溶液搅拌混合后，用1mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH为8.0；然后将反应溶液除氧30min，之后加入2.0mL浓度为0.02mol/L的Na2S水溶液，在一定温度下除氧反应一段时间，得水溶性PbS量子点；b、将PbS量子点与壳聚糖依次修饰到电极表面：将预处理的ITO玻璃片浸在含有NaCl的2％PDDA聚合物的溶液中，10min后洗净；然后再浸入到水溶性PbS量子点溶液中，30分钟后取出洗净；用pH＝4.0的醋酸缓冲配制2wt％质量浓度的壳聚糖溶液，之后用pH＝7.0的醋酸缓冲液稀释成0.5wt％的浓度；吸取20uL稀释后的壳聚糖溶液滴加到PbS量子点电极上，在室温下干燥，备用；c、酪氨酸酶活性的测定：在96微孔板中，将20μL不同浓度的酪氨酸酶、20μL1mmol/L的酪氨酸酶底物和160μL浓度为0.1mol/L的pH＝7.0磷酸盐缓冲溶液混合，37℃下震荡反应90min；随后，将制备好的沉积了PbS以及壳聚糖的光电极浸没在上述反应后的溶液中，10min后取出洗涤，将电极放在盛有除氧后的0.1mol/L的pH＝7.0Tris‑HCl缓冲溶液中进行光电化学检测。...

【技术特征摘要】
1.一种高通量的光电化学酪氨酸酶传感器，其特征在于：a、以巯基乙酸作为表面修饰剂制备水溶性PbS量子点，具体步骤为：将一定体积的巯基乙酸和25mL4.0mmol/L的Pb(CH3COO)2溶液搅拌混合后，用1mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH为8.0；然后将反应溶液除氧30min，之后加入2.0mL浓度为0.02mol/L的Na2S水溶液，在一定温度下除氧反应一段时间，得水溶性PbS量子点；b、将PbS量子点与壳聚糖依次修饰到电极表面：将预处理的ITO玻璃片浸在含有NaCl的2％PDDA聚合物的溶液中，10min后洗净；然后再浸入到水溶性PbS量子点溶液中，30分钟后取出洗净；用pH＝4.0的醋酸缓冲配制2wt％质量浓度的壳聚糖溶液，之后用pH＝7.0的醋酸缓冲液稀释成0.5wt％的浓度；吸取20uL稀释后的壳聚糖溶液滴加到PbS量子点电极上，在室温下干燥，备...

【专利技术属性】
技术研发人员：王光丽，袁芳，王红，董玉明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32