本发明专利技术属于生物医学技术领域，涉及一种人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒。本发明专利技术人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，包括红细胞裂解液、无ＲNA 酶水、ＲNA提取液、dNTP 混合物、逆转录酶储存液、反转录缓冲液、PCR反应缓冲液、UNG酶储存液、引物对、探针、标准品、阳性质控品、阴性质控品。本发明专利技术人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒具有较高的特异性、灵敏性、准确性及质量控制等优点。
【技术实现步骤摘要】
一种人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒
本专利技术属于生物医学
，涉及一种人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
技术介绍
乳腺癌作为一种常见的恶性肿瘤，严重威胁女性的生命和健康。近年来我国乳腺癌的发病率明显增高，目前，我国乳腺癌发病率为42.55/10万，居女性恶性肿瘤的第一位。目前，乳腺癌的治疗方法有多种，如手术、放疗、化疗及生物治疗等，其中以乳腺癌手术切除为主要治疗措施，但术后复发和转移已成为阻碍患者生存期提高的主要原因。血行播散是肿瘤转移的主要途径之一，由于自然或侵袭性医源性因素，癌细胞可从原发灶脱落形成循环肿瘤细胞，但是目前的检测方法灵敏度及特异性较低，不能检测到微量的癌细胞，这些癌细胞随血液到达外周组织并处于休眠状态，当患者机体免疫功能下降时，休眠的癌细胞就有可能被激活，从而导致了乳腺癌的复发和转移，循环肿瘤细胞的数量与乳腺癌的进展及患者生存期等密切相关。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过RT-PCR技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。实时荧光定量PCR技术是一种能够准确定量mＲNA的检测方法，通过检测人乳腺癌特异性基因1（BCSG1）mＲNA的表达以判断循环乳腺肿瘤细胞的存在。人乳腺癌特异性基因1（BCSG1）是一种特异性的在乳腺癌中选择性表达的基因，其定位于人类染色体10q23，DNA长度约5kb。BCSG1基因编码合成1条含127个氨基酸的蛋白，其在乳腺癌组织中特异性表达，在正常乳腺或良性乳腺病变中几乎不表达，是一种与乳腺癌进展有关的肿瘤标记物。BCSG1基因的表达与肿瘤分期、淋巴结浸润、肿瘤体积及转移等密切相关，在III/IV期乳腺癌中BCSG1的阳性率为71.4%或81%，I/II患者中阳性率为26.8%或15%，BCSG1阳性的乳腺癌患者其生存期较BCSG1阴性患者明显缩短。正常人外周血BCSG1mＲNA呈阴性；游离于细胞外的mＲNA很不稳定，极易被ＲNA酶解，故在外周血中若测得BCSG1mＲNA，则提示血循环中存在有完整的乳腺癌细胞，但目前尚没有合适的阳性率高的检测技术。由于目前通过实时荧光定量PCR技术检测人乳腺癌特异性基因1（BCSG1）mＲNA的表达以判断循环乳腺肿瘤细胞的阳性率低，不具有临床应用价值，因此，研制一种较高的特异性、灵敏性、准确性及质量控制的BCSG1mＲNA实时荧光定量ＲT-PCＲ检测试剂盒是非常必要的。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本专利技术人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒具有较高的特异性、灵敏性、准确性及质量控制等优点。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为。一种人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括红细胞裂解液、无ＲNA酶水、ＲNA提取液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、反转录缓冲液、PCR反应缓冲液、UNG酶储存液、引物对、探针、标准品、阳性质控品、阴性质控品。所述红细胞裂解液是由pH7.60.01mol/LTris-HCl、0.01mol/LNaCl和0.005mol/LMgCl2组成。所述引物为包含BCSG1基因的上游引物和正常的下游引物，序列分别如下：上游引物：5’-GGGTGAGGCATCCAAAGAGA-3’；下游引物：5’-TGGGCAGCCGCATGTC-3’。所述探针由通常的核苷酸引物合成仪合成，序列如下：扩增BCSG1基因的引物序列如下：5’-FAM-AGAGGAAGTGGCAGAGGAGGCCCA-TAMＲA-3’。所述阳性质控品为含有BCSG1mＲNA的总ＲNA。所述阴性质控品为不含BCSG1mＲNA的总ＲNA。所述标准品采用BCSG1质粒使用TE溶液溶解，浓度为2×107拷贝数/μL。本专利技术的有益效果：（1）本专利技术优化了试剂盒中的引物、探针、定值标准品、设立阳性、阴性质控品提高了试剂盒的特异性、灵敏性、准确性及质量控制等性能，本专利技术试剂盒的特异度及准确性均为95%以上，灵敏度为100拷贝/mL(全血)，稳定性较好，在-20℃中保存12个月其性能未发生变化。（2）本专利技术试剂盒对外周血标本中BCSG1mＲNA的检测结果表明，12例临床确诊已转移的乳腺癌患者检测结果均为阳性，21例临床未确诊转移的乳腺癌患者中12例为阳性，其余9例为阴性;15例乳腺良性疾病患者、10例正常人均为阴性，未检测到BCSG1mＲNA的表达，临床确诊已转移的乳腺癌患者外周血中BCSG1mＲNA表达量和阳性率明显高于未确诊转移的乳腺癌患者、乳腺良性疾病患者及正常人。由此可推测外周血样品中BCSG1mＲNA的表达量与患者的临床分期等密切相关，是一项较好的血源性乳腺癌细胞的监测指标，可作为乳腺癌患者诊疗过程中的重要监测指标。本专利技术试剂盒检测乳腺癌患者血中的BCSG1mＲNA的表达量，对判断乳腺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义。附图说明图1本专利技术试剂盒检测外周血BCSG1mＲNA的定量检测结果。具体实施方式为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本专利技术的特征和优点，而不是对本专利技术权利要求的限制。1、本专利技术人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒本专利技术试剂盒包括红细胞裂解液（由pH7.60.01mol/LTris-HCl、0.01mol/LNaCl和0.005mol/LMgCl2组成）、无ＲNA酶水、ＲNA提取液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、反转录缓冲液、PCR反应缓冲液、UNG酶储存液、引物对、探针、标准品（采用BCSG1质粒使用TE溶液溶解，浓度为2×107拷贝数/μL）、阳性质控品（含有BCSG1mＲNA的总ＲNA）、阴性质控品（不含BCSG1mＲNA的总ＲNA）。所述引物为包含BCSG1基因的上游引物和正常的下游引物，序列分别如下：上游引物：5’-GGGTGAGGCATCCAAAGAGA-3’；下游引物：5’-TGGGCAGCCGCATGTC-3’。所述探针由通常的核苷酸引物合成仪合成，序列如下：扩增BCSG1基因的引物序列如下：5’-FAM-AGAGGAAGTGGCAGAGGAGGCCCA-TAMＲA-3’。2、本专利技术人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒实验步骤如下：第一步外周血有核细胞分离采静脉血3mL于5mLEDTA抗凝管中，使用红细胞裂解液裂解红细胞，4℃，450g，离心10min，收集有核细胞，备用。第二步总ＲNA提取外周血有核细胞、K562细胞(阴性对照)和SK-BＲ-3细胞(阳性对照)的总ＲNA均按Trizol试剂盒方法提取。第三步实时荧光定量RT-PCR（1）RT反应：总体积为10μL，包括反转录反应液3.5μL、总ＲNA溶液5.0μL、无ＲNA酶的水1.5μL。反应条件为：37℃，20min：95℃，5min。反应结束后，将反应产物取出置于冰盒上，备用。（2）标准品的处理：将标准品储存液（2×107拷贝数/μL）梯度稀释为2×106，2×本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于： 包括红细胞裂解液、无ＲNA 酶水、ＲNA提取液、dNTP 混合物、逆转录酶储存液、反转录缓冲液、PCR反应缓冲液、UNG酶储存液、引物对、探针、标准品、阳性质控品、阴性质控品。
【技术特征摘要】
1.一种人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：包括红细胞裂解液、无ＲNA酶水、ＲNA提取液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、反转录缓冲液、PCR反应缓冲液、UNG酶储存液、引物对、探针、标准品、阳性质控品、阴性质控品。2.根据权利要求1所述的人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述红细胞裂解液是由pH7.60.01mol/LTris-HCl、0.01mol/LNaCl和0.005mol/LMgCl2组成。3.根据权利要求1所述的人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述引物为包含BCSG1基因的上游引物和正常的下游引物，序列分别如下：上游引物：5’-GGGTGAGGCATCCAAAGAGA-3’；下游引物：5’-TGGGCAGCCGC...
【专利技术属性】
技术研发人员：任秀敏，
申请(专利权)人：任秀敏，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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