一种重组犬C反应蛋白及其单克隆抗体的制备制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种多肽，该多肽包含犬C反应蛋白(CRP)两个优势抗原表位，为增强其免疫效果，将该多肽偶联KLH蛋白。本发明专利技术提供了一种犬CRP重组蛋白，该重组蛋白主要包含犬CRP两个优势抗原表位。为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应核苷酸序列，通过化学合成该核苷酸序列并构建重组蛋白表达载体。本发明专利技术还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过抗原免疫、细胞融合及多轮筛选后得到单克隆细胞株，纯化单克隆抗体并分别标记荧光微球，通过正交实验确定最佳单抗配对组合，可用于炎症诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种重组犬C反应蛋白及其单克隆抗体的制备
本专利技术属于生物
，涉及一种多肽，化学合成该多肽并偶联KLH蛋白。同时涉及一种重组蛋白、编码该重组蛋白的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的质粒载体、转化含有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述KLH偶联蛋白制备犬C反应蛋白单克隆抗体，使用上述重组蛋白筛选犬C反应蛋白单克隆抗体并应用于犬炎症早期诊断。
技术介绍
机体在受到创伤、感染等刺激时，会出现急性期反应，受到刺激的巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞会释放一些促炎因子，促进肝脏合成一些血急性期反应蛋白。不同物种急性期反应蛋白略有不同，C反应蛋白(CRP)是犬最主要的急性期反应蛋白。在发挥机体固有免疫反应方面起着积极作用，在多种疾病中会出现显著变化，是急性感染和炎症性疾病的一种生物标志物，在疾病治疗监测和预后方面起着非常重要作用。因此，能够在疾病早期对犬C反应蛋白做出正确诊断显得尤为重要。近30年来，研究者探索出了多种CRP检测方法，主要包括：乳胶凝集法、ELISA、以及免疫层析法。在这些检测方法中，乳胶凝集法是半定量检测法，目前已经基本上被淘汰；ELISA能检出极低浓度CRP，但试验流程繁琐、消耗时间长且极低浓度CRP的临床意义有限；免疫层析法由于其操作极为简单，且结果不受脂血症和溶血的影响，适合临床应用。免疫层析法具体采用单克隆抗体识别检测犬C反应蛋白，该方法特异性及灵敏度俱佳。若结合荧光微球平台，一般能在10～15分钟内获得准确结果，适合大批量样本快速检测，无特殊人员要求。目前，免疫学方法检测犬C反应蛋白由于操作简便、结果易于判定，已成为主流方向。该方法通常需要制备可识别犬C反应蛋白的单克隆抗体，常规犬C反应蛋白单克隆抗体制备所使用的免疫原是基因工程技术表达的完整蛋白，由于碱基密码子的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难、表达量极低，导致后续纯化工作难以开展，严重阻碍其单克隆抗体制备。另外，由于抗原表位氨基酸序列同源性缘故，使用犬C反应蛋白全长序列作为免疫原制备得到的单克隆抗体特异性差，与其它物种蛋白具有高度同源性，从而导致检测结果失真。
技术实现思路
设计目的：为解决免疫学方法检测犬C反应蛋白的不足之处，通过设计、合成KLH偶联蛋白并制备其单克隆抗体，同时通过设计、表达重组犬C反应蛋白筛选其单克隆抗体来实现对犬C反应蛋白特异性检测识别，既增强了检测灵敏度兼顾其广谱性，又不会导致检测结果失真。设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以犬C反应蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原两个优势抗原表位，序列比较结果显示所选择的两个抗原表位是所有犬C反应蛋白共有表位并与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为增强免疫效果并缩短单克隆抗体制备时间，将所选择的两个优势抗原表位串联并偶联KLH蛋白，用其免疫小鼠。(3)将所选择的两个优势抗原表位序列分别通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后重复，形成重组犬C反应蛋白氨基酸序列。(4)为提高该重组蛋白表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列。(5)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-28a(+)，构建重组犬C反应蛋白表达载体。(6)重组犬C反应蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选得到重组蛋白表达菌株。(7)重组蛋白表达菌株大规模培养后，经超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化重组犬C反应蛋白。(8)KLH偶联蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，使用重组犬C反应蛋白多轮筛选最终得到分泌犬C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(9)将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用ProteinA亲和层析法纯化单克隆抗体，并分别标记荧光微球。(10)正交实验筛选显示7E6单抗包被与2A9单抗标记配对为最佳检测犬C反应蛋白组合。设计方案1：一种重组蛋白，该重组蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQIDNo：1所示的氨基酸序列。设计方案2：一种重组蛋白，该重组蛋白质的氨基酸序列包含如序列表SEQIDNo：3和SEQIDNo：4所示氨基酸序列。设计方案3：一种多肽，该多肽的氨基酸序列如序列表SEQIDNo：2所示的氨基酸序列。设计方案4：一种多肽，该多肽的氨基酸序列包含如序列表SEQIDNo：3和SEQIDNo：4所示氨基酸序列。设计方案5：一种核苷酸序列，该核苷酸序列如序列表SEQIDNo：5所示，可编码权利1-2所述的重组犬C反应蛋白。设计方案6：一种质粒载体，该质粒载体含有权利要求5所述的核苷酸序列。设计方案7：一种菌株，该菌株包含采用权利要求6所述的质粒载体。本专利技术与
技术介绍
相比，一是采用大肠杆菌偏爱密码子优化重组蛋白对应的核苷酸序列，从而大大提高了重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平；二是作为免疫原的KLH偶联蛋白仅含有犬C反应蛋白特有的优势抗原表位，保证了最终得到的单克隆抗体仅特异性识别犬C反应蛋白，并筛选得到了最优单抗配对组合，提高了检测灵敏度；三是免疫原含有的优势抗原表位是所有犬C反应蛋白的共有抗原表位，保证了检测广谱性，避免漏检。具体实施方式以下实施例虽然对本专利技术的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本专利技术设计思路的简单文字描述，而不是对本专利技术设计思路的限制，任何不超出本专利技术设计思路的组合、增加或修改，均落入到本专利技术的保护范围内。实施例1：犬C反应蛋白优势抗原表位选择以犬C反应蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位(SEQIDNo：3)和B优势抗原表位(SEQIDNo：4)。同时，序列比较结果显示所选择的A、B两个优势抗原表位序列具备广谱性，是所有犬C反应蛋白共有表位；并且A、B表位与其它蛋白序列无明显同源性，仅存在于犬C反应蛋白序列。实施例2：合成含有犬C反应蛋白优势抗原表位的多肽为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的激活效果以缩短单克隆抗体制备时间，化学合成犬C反应蛋白A、B两个优势抗原表位序列并串联，同时在末端连接半胱氨酸(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，得到多肽，其具体序列如序列表SEQIDNo：2所示。实施例3：多肽偶联KLH蛋白将20mgSMCC溶于2mlDMF(二甲基甲酰胺)，将0.8mlKLH加入到25ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH7.2)使蛋白终浓度为15mg/ml。将溶解的SMCC溶液缓慢滴加到120mgKLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h。用1L1×PBS(PH7.4)溶液于4℃下透析6小时，除去游离的SMCC。将透析后KLH蛋白倒入50ml离心管中，得到体积为20ml。取出417ulKLH-SMCC溶液转移到5m1离心管中。将3.0mg多肽用0.6ml1×PBS(pH7.2)溶液溶解。用E1lman试剂检测多肽中的巯基，0D值为0.18，将多肽液滴加KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。用Ellman试剂检测得到0D值为0.02，且试剂不显黄色，得到KLH偶联蛋白。实施例4：犬C反应蛋白优势抗原表位的串联将犬C反应蛋白A、B两个优势抗原表位序列分别通过柔性片段(连续四个甘氨酸)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：1所示氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQIDNo：1所示氨基酸序列。2.一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白质的氨基酸序列包含如序列表SEQIDNo：3和SEQIDNo：4所示氨基酸序列。3.一种多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列如序列表SEQIDNo：2所示氨基酸序列。4.一种多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列包含如序列表SEQIDNo：3和SEQIDNo：4所示氨基酸序列。5.一种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如序列表SEQIDNo：5所示，可编码权利1-2所述的重组蛋白。6.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求5所述的核苷酸序列。7.一种菌株，其特征在于该菌株包含采...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡祥叶，余铭恩，项美华，朱伟，王璐，刘清泉，吴琼杉，曹丹琴，武戌青，王立童，
申请(专利权)人：杭州贤至生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33