小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法。所述方法对分化的细胞进行定向诱导，最终制备得到血管内皮细胞；所述定向诱导包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制TGF‑β的信号通路，抑制DNA甲基转移酶(DNMT)的活性，激活WNT/β‑catenin的信号通路以及激活cAMP的信号通路。本发明专利技术通过小分子化合物组合诱导，能够将分化的细胞转分化为血管内皮细胞，各步骤可实现精准质控，便于标准化操作和规模化生产。本发明专利技术提供的方法供体来源广泛，患者本人即可作为供体，可在较短时间内获得基础研究、临床治疗或组织工程生产所需的血管内皮细胞。

【技术实现步骤摘要】
小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法
本专利技术涉及细胞生物学，组织工程和再生医学领域，尤其涉及一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法。
技术介绍
：血管内皮细胞(vascularendothelialcell,VEC)作为血管结构性内壁，对维持血管的正常形态与生理功能具有重要意义。具有代谢活性的血管内皮细胞在活体中有抗血栓作用，是组织工程血管植入后确保远期通畅率的关键，也是临床治疗中血管再生基础。随着创伤、器官移植、心血管疾病冠脉搭桥等患者群体数量不断增多，市场对作为组织工程血管或血管再生医学种子细胞的血管内皮细胞或其前体细胞的需求量也逐年增加。目前再生医学或组织工程所需的血管内皮细胞主要来源于同种异体捐赠，或从胚胎干细胞、iPS细胞或成体干细胞诱导而来，但存在来源有限、获取过程复杂、细胞纯度较低、具有免疫原性与致瘤风险等问题，因而临床应用受限。多种分化的细胞如皮肤成纤维细胞具有来源丰富、易于获取并易于在体外长期大量扩增培养的优点。目前利用细胞转分化技术已经可以把分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接诱导为成肌细胞、神经元、肝细胞、成骨细胞等多种不同类型的功能细胞；或先诱导为多能干细胞后，再进一步定向诱导为相应的功能细胞。上述采用细胞转分化技术从某种特定分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接或间接诱导获得的功能细胞已经不再保持源细胞的分子特征与功能，但获得了相应目标细胞的典型分子特征与细胞功能。目前，上述诱导性功能细胞已逐渐应用于疾病模型研究、临床治疗研究与组织工程研究。传统的细胞转分化需要通过导入特定的外源性基因实现，有时还需要相应的小分子化合物、细胞因子或重组蛋白协同作用。文献已有较多采用特定外源性基因把某一分化的细胞诱导为另一功能性分化的细胞的报道。如文献已有采用BMP-2，BMP-7，LMP3单独或协同作用使皮肤成纤维细胞转分化为在体外、体内都具有骨形成作用的成骨细胞的报道。但导入外源性基因存在致瘤风险，并可能使目标细胞产生免疫原性，难以推广应用。2013年，邓宏魁报道仅采用小分子化合物或其组合可以实现鼠皮肤成纤维细胞重编程为神经细胞的转分化过程，并证实该细胞转分化技术具有诱导过程短、诱导系统稳定、易于质控、成本低、无外源性基因插入导致的致瘤风险、获得的目标细胞具有良好的安全性与稳定性且无免疫原性，具有潜在的临床应用价值与产业化前景。此后，申请号为201410075246.5的中国专利申请提供了一种把分化的细胞诱导转分化为神经干细胞的方法及其应用。具体地，该申请涉及采用组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂和转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂的组合，在正常生理低氧环境下诱导成纤维细胞、上皮细胞等分化的细胞转分化为具有良好多能性及传代稳定性的神经干细胞。申请号为201610213644.8的中国专利申请提供了一种诱导成纤维细胞转分化为心肌细胞的诱导培养基、方法及其应用，所述诱导培养基包含基础培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为6TCFOW或SCFOV，其中6为E61541、T为苯环丙胺、C为CHIR99021、F为毛喉素、O为Dorsomorphin、W为IWR-1、S为SB431542、V为丙戊酸。该申请诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为心肌细胞。目前，通过采用单纯小分子化合物或其组合诱导人类分化的细胞如皮肤成纤维细胞获得施旺细胞(THOMAEC，etal，2014)、神经细胞(HUW，etal，2015)、胰岛细胞(ShengDing，etal，2015)的成果已陆续见诸报道。由于人类与小鼠存在约25％的基因差异，而将上述在小鼠细胞实验中获得成功的专利申请技术方案应用于人的同类细胞转分化可行性不高；另一方面，由于诱导同类细胞转分化获得不同目标细胞的具体理论基础与技术手段并不相同，申请人采用上述报道的技术方案分别重复试验，既未能把应用于小鼠细胞的转分化技术方案成功应用于人的同类细胞转分化，也未能把人类分化的细胞诱导转分化为血管内皮细胞。
技术实现思路
本专利技术提供一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法。本专利技术提供的方法根据调控相应的信号通路和表观遗传修饰，利用小分子化合物的组合处理分化的细胞快速稳定地获得大量血管内皮细胞和/或其产物。本专利技术第一方面，一种诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法，所述方法对分化的细胞进行定向诱导，最终制备得到血管内皮细胞；所述定向诱导包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶(Lysinedeacetylasesinhibitors，KDACIs)的活性，抑制TGF-β的信号通路，激活WNT/β-catenin的信号通路，激活cAMP的信号通路，以及抑制DNA甲基转移酶(DNMT)的活性和/或抑制组蛋白甲基转移酶(HistoneMethyltransferase，HMT)的活性。进一步地，所述定向诱导还进一步包括抑制组蛋白去甲基化酶的活性和/或抑制JNK的信号通路和/或抑制ROCK的信号通路和/或抑制PKC的活性和/或激活RA(Retinoicacid)的信号通路。更进一步地，根据本专利技术提出的信号通路和/或酶，可以采用小分子化合物调控相应的信号通路和/或酶，即所述定向诱导采用诱导化合物接触分化的细胞，最终制备得到血管内皮细胞；所述诱导化合物包括赖氨酸脱乙酰基酶的抑制剂，TGF-β受体抑制剂，WNT/β-catenin激动剂，cAMP激动剂和DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferas，DNMT)抑制剂。进一步地，所述诱导化合物还包括组蛋白甲基转移酶(HistoneMethyltransferase，HMT)抑制剂，组蛋白去甲基化酶抑制剂，JNK抑制剂和ROCK(Rho-associatedproteinkinase)抑制剂,PKC抑制剂，RAR(RetinoicacidReceptor)激动剂中的至少一种。进一步地，所述诱导化合物还包括ascorbate(抗坏血酸)，细胞生长因子b-FGF，EGF，VEGF和IGF-1中的至少一种；或所述ascorbate(抗坏血酸)和/或细胞生长因子b-FGF和/或EGF和/或VEGF和/或IGF-1在进行上述方法后与相应的细胞或细胞产物接触。所述的分化细胞来源于哺乳动物如人，包括成纤维细胞，上皮细胞，脂肪细胞。优选地所述分化细胞是皮肤成纤维细胞。本专利技术第二方面，还提供一种小分子化合物组合，所述小分子化合物包括所述诱导化合物，或包括调控上述信号通路和/或酶活性的化合物(包括信号通络的抑制剂或激活剂，以及酶的抑制剂或激活剂)。所述小分子化合物组合中赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂包括sodiumphenylbutyrate，butyrate，sodiumbutyrate，MC1568，CI994(Tacedinaline)，chidamide，CAY10683(SantacruzaMateA)，CUDC-907，M344(HistoneDeacetylaseInhibitorIII)，LAQ824(NVP-LAQ824，Dacinostat)，Pracinostat(SB939)，V本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法，其特征在于，所述方法对分化的细胞进行定向诱导，最终制备得到血管内皮细胞；所述定向诱导包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶(Ly sine deacetylases inhibitors，KDACIs)的活性，抑制TGF‑β的信号通路，激活WNT/β‑catenin的信号通路，激活cAMP的信号通路，以及抑制DNA甲基转移酶(DNMT)的活性和/或抑制组蛋白甲基转移酶的活性。

【技术特征摘要】
1.一种诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法，其特征在于，所述方法对分化的细胞进行定向诱导，最终制备得到血管内皮细胞；所述定向诱导包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶(Lysinedeacetylasesinhibitors，KDACIs)的活性，抑制TGF-β的信号通路，激活WNT/β-catenin的信号通路，激活cAMP的信号通路，以及抑制DNA甲基转移酶(DNMT)的活性和/或抑制组蛋白甲基转移酶的活性。2.如权利要求1所述的诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法，其特征在于，所述定向诱导还进一步包括抑制组蛋白去甲基化酶的活性和/或抑制JNK的信号通路和/或抑制ROCK的信号通路和/或抑制PKC的活性和/或激活RA(Retinoicacid)的信号通路。3.如权利要求1所述的诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法，其特征在于，所述定向诱导采用诱导化合物接触分化的细胞，最终制备得到血管内皮细胞；所述诱导化合物包括赖氨酸脱乙酰基酶的抑制剂，TGF-β受体抑制剂，WNT/β-catenin激动剂，cAMP激动剂和DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferas,DNMT)抑制剂。4.如权利要求3所述的诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法，其特征在于，所述诱导化合物还包括组蛋白甲基转移酶(HistoneMethyltransferase，HMT)抑制剂，组蛋白去甲基化酶抑制剂，JNK抑制剂和ROCK(Rho-associatedproteinkinase)抑制剂,PKC抑制剂，RAR(RetinoicacidReceptor)激动剂中的至少一种。5.如权利要求3或4所述的诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法，其特征在于，所述诱导化合物还包括ascorbate(抗坏血酸)，细胞生长因子b-FGF，EGF，VEGF和IGF-1中的至少一种；或所述ascorbate(抗坏血酸)和/或细胞生长因子b-FGF和/或EGF和/或VEGF和/或IGF-1在进行权利要求1～4任一所述的方法后与相应的细胞或细胞产物接触。6.一种小分子化合物组合，其特征在于，所述小分子化合物组合包括权利要求3～5任一所述中的诱导化合物，或包括调控权利要求1～2任一所述的调控信号通路和/或酶活性的化合物。7.如权利要求6所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述小分子化合物组合中赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂包括sodiumphenylbutyrate，butyrate，sodiumbutyrate，MC1568，CI994(Tacedinaline)，chidamide，CAY10683(SantacruzaMateA)，CUDC-907，M344(HistoneDeacetylaseInhibitorIII)，LAQ824(NVP-LAQ824，Dacinostat)，Pracinostat(SB939)，VPA，Scriptaid，Apicidin，LBH-589(Panobinostat)，MS-275，SAHA(Vorinostat)，Trichostatin(TSA)，PsammaplinA，PCI-24781(Abexinostat)，Rocilinostat(ACY-1215)，Mocetinostat(MGCD0103)，4-Phenylbutyrate(4PB)，splitomicin，SRT1720，resveratrol，Sirtinol，APHA，CI-994，Depudecin，FK-228，HC-Toxin，ITF-2357(Givinostat)，Chidamide，RGFP966，PHOB，BG45，NexturastatA，TMP269，CAY10603，MGCD-0103，Niltubacin，PXD-101(Belinostat)，Pyroxamide，Tubacin，EX-527，BATCP，Cambinol，MOCPAC，PTACH，MC1568，NCH51和TC-H106中的至少一种；所述TGF-β受体抑制剂包括616452，LY2109761，Pirfenidone，Repsox(E-616452)，SB431542，A77-01，Tranilast，Galunisertib(LY2157299)，A8301，GW788388，ITD-1，SD208，SB525334，LY364947，ASP3029，D4476和SB505124中的至少一种；所述WNT/β-catenin激活剂包括MAY-262611，CHIR98014，CHIR99021，LiCl，Li2CO3，TD114-2，AZD2858，AZD1080，BIO，Kenpaullone，TWS119，LY2090314，CBM1078，SB216763和AR-A014418中的至少一种；所述cAMP激活剂包括EPAC/RAP1激活剂，8-Bromo-cAMP，Dibutyryl-Camp和Sp-8-Br-cAMPs中的至少一种；所述EPAC/RAP1激活剂包括Forskolin，IBMX，ProstaglandinE2(PGE2)，NKH477，8-pCPT-2′-O-Me-cAMP，GSK256066，Apremilast(CC-10004)，Roflumilast，Cilomilast，Rolipram和Milrinone中的至少一种；所述ROCK抑制剂包括Y-27632，Y-276322HCl，Thiazovivin，Ripasudil(K-115)，Fasudil，Fasudil(HA-1077)HCl，GSK429286A，RKI-1447和PKI-1313中的至少一种；所述JNK抑制剂包括SP600125，JNKInhibitorIX，AS601245，AS602801和JNK-IN-8中的至少一种；所述DNMT抑制剂包括RG108，Thioguanine，5-Aza-2'-deoxycytidine(Decitabine)，SGI-1027，Zebularine和5-Azacytidine(AZA)中的至少一种；所述HMT抑制剂包括EPZ004777，EPZ5676，GSK503，BIX01294和SGC0946中的至少一种；所述组蛋白去甲基化酶抑制剂包括parnate(tranylcypromine)，Tranylcypromine(2-PCPA)HCl，SP2509，4SC-202，ORY-1001(RG-6016)，GSKJ1和GSK-LSD1中的至少一种；所述PKC抑制剂包括Go6983,Ro31-8220Mesylate,Go6976和BisindolylmaleimideI(GF109203X)的至少一种；所述RAR激动剂包括TTNPB，Bexarotene，Ch55，Tamibarotene，Retinol，AM580，ATRA，VitaminA,VitaminA衍生物和13-cisRA中的至少一种。8.如权利要求6所述的小分子化合物的组合，其特征在于，所述小分子化合物组合采用下列组合中的任一项：VPA+CHIR99021+Repsox+Rolipram+EPZ004777；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+TSA+5-Aza-2'-deoxycytidine；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+TSA+RG108；VPA+CHIR99021+Repsox+Rolipram+EPZ004777+RG108；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+Go6983+5-Aza-2'-deoxycytidine；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+5-Aza-2'-deoxycytidine+EPZ004777；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+RG108；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+-Aza-2'-deoxycytidine；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+TSA+RG108+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+5-Aza-2'-deoxycytidine+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+RG108；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+5-Aza-2'-deoxycytidine；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+TSA+5-Aza-2'-deoxycytidine+SP600125；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+TSA+5-Aza-2'-deoxycytidine+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+5-Aza-2'-deoxycytidine+SP600125；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+SP600125；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+SP600125+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+SP600125+Go6983+Y-27632；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+SP600125+Go6983+Y-27632+sodiumbutyrate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+RG108+Go6983+Y-27632+sodiumbutyrate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+RG108+SP600125+Go6983+Y-27632；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+SP600125+Y-27632；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+Y-27632+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Rolipram+EPZ004777+Y-27632；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+TSA+5-Aza-2'-deoxycytidine+sodiumbutyrate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+5-Aza-2'-deoxycytidine+sodiumbutyrate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+TSA+5-Aza-2'-deoxycytidine+sodiumbutyrate+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Y-27632+5-Aza-2'-deoxycytidine+ascorbate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Y-27632+5-Aza-2'-deoxycytidine+ascorbate+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+SP600125+Y-27632+ascorbate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+Y-27632+ascorbate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+TSA+5-Aza-2'-deoxycytidine+Y-27632+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+RG108；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+Y-27632；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+RG108+Y-27632；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+Y-27632+ascorbate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+RG108+ascorbate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+RG108+Y-27632+ascorbate；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+RG108+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+Y-27632+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+RG108+Y-27632+Go6983；VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+EPZ004777+AM580+Y-27...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡敏，李燕皎，王兆杰，
申请(专利权)人：昆明学院，云南省科学技术院，
类型：发明
国别省市：云南,53