人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化制造技术

本发明专利技术提供促进胰腺内胚层细胞分化成胰腺内分泌富集聚簇并增强激素表达细胞中的胰岛素表达的方法。

Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells

The invention provides a method for promoting the differentiation of pancreatic endoderm cells into pancreatic endocrine, enriching clusters and enhancing the expression of insulin in hormone expression cells.

【技术实现步骤摘要】
人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化本申请是申请日为2013年6月6日，申请号为201380030234.4(PCT/US2013/044472)，专利技术名称为“人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求于2012年6月8日提交的美国临时专利申请序列号61/657,160的权益，其全文以引用方式并入本文以用于任何目的。
本专利技术在细胞分化领域中。更具体地，本专利技术公开了肝配蛋白配体和鞘氨醇-1-磷酸作为多能干细胞向内分泌细胞分化的调节因子的用途。
技术介绍
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于植入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞诸如例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。在脊椎动物的胚胎发育中，多能细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。组织(诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏)将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是定形内胚层的形成。定形内胚层细胞表达多种标记物，诸如HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。到原肠胚形成为止，内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前-后域，所述因子唯一地标记内胚层的前、中和后区。例如，Hhex和Sox2鉴定内胚层的前区，而Cdx1、2和4鉴定内胚层的后半部分。内胚层组织的迁移使内胚层与不同的中胚层组织紧密接近，这帮助肠管的区域化。这通过多种分泌因子诸如FGF、Wnt、TGF-B、视黄酸(RA)和BMP配体及其拮抗剂来完成。例如，FGF4和BMP促进预定的后肠内胚层中的Cdx2表达并阻遏前基因Hhex和SOX2的表达(2000Development，127：1563-1567)。WNT信号传导也已显示与FGF信号传导平行工作，以促进后肠发育并抑制前肠命运(2007Development，134：2207-2217)。最后，由间充质分泌的视黄酸调节前肠-后肠边界(2002CurrBiol，12：1215-1220)。特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。在定形内胚层转化成原肠管的过程中，肠管变得区域化成广泛域，所述广泛域可通过限制性基因表达模式在分子水平上进行观察。例如，肠管中区域化的胰腺域显示PDX-1的极高表达以及CDX2和SOX2的极低表达。相似地，高水平的Foxe1的存在指示食道组织；在肺组织中高度表达的是NKX2.1；SOX2/Odd1(OSR1)在胃组织中高度表达；PROX1/Hhex/AFP的表达在肝组织中较高；SOX17在胆道结构组织中高度表达；PDX1、NKX6.1/PTf1a和NKX2.2在胰腺组织中高度表达；并且CDX2的表达在肠组织中高。上文概括摘自DevDyn2009，238：29-42和AnnuRevCellDevBiol2009，25：221-251。胰腺的形成起于定形内胚层分化成胰腺内胚层(2009AnnuRevCellDevBiol，25：221-251；2009DevDyn，238：29-42)。背侧和腹侧胰腺域产生自前肠上皮。前肠也产生食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝、胰腺和胆管系统。胰腺内胚层的细胞表达胰-十二指肠同源盒基因PDX1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织产生自胰腺内胚层的分化。D’Amour等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下，产生人胚胎干细胞(ES)衍生出的定形内胚层的富集培养物(NatureBiotechnol2005，23：1534-1541；美国专利7,704,738)。将这些细胞移植在小鼠的肾包膜下导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟的细胞(美国专利7,704,738)。在添加FGF-10和视黄酸后，人胚胎干细胞衍生出的定形内胚层细胞还可进一步分化成PDX1阳性细胞(美国专利公开2005/0266554A1)。这些胰腺前体细胞在免疫缺陷小鼠的脂肪垫中的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能胰腺内分泌细胞(美国专利7,993,920和美国专利7,534,608)。Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(美国专利7,033,831)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。人胚胎干细胞首先使用丁酸钠和激活素A的组合而分化成内胚层(美国专利7,326,572)。然后将细胞和与EGF或β细胞素(betacellulin)结合的BMP拮抗剂诸如头蛋白(Noggin)一起培养，以生成PDX1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。小分子抑制剂也已用于诱导胰腺内分泌前体细胞。例如，TGF-B受体和BMP受体的小分子抑制剂(Development2011，138：861-871；Diabetes2011，60：239-247)已用于显著提高胰腺内分泌细胞的数目。另外，小分子活化剂也已用于生成定形内胚层细胞或胰腺前体细胞(CurrOpinCellBiol2009，21：727-732；NatureChemBiol2009，5：258-265)。虽然已在由人多能干细胞产生胰腺细胞的方案方面取得重大进步，但仍然需要建立产生功能性内分泌细胞且尤其是β细胞的方案。在此，我们证实一类肝配蛋白配体和鞘氨醇-1-磷酸或鞘氨醇受体的激动剂增强了内分泌细胞的产生并加速内分泌激素和内分泌前体细胞的聚簇。
技术实现思路
在一个实施例中，本专利技术涉及通过在包含肝配蛋白A4或肝配蛋白A3的培养基中培养胰腺内胚层细胞群来增强胰岛素和NKX6.1的表达的方法。在一些实施例中，胰腺内胚层细胞群基本上不表达CDX2或SOX2。在一些实施例中，胰腺内胚层细胞群通过多能细胞的逐步分化获得。在一些实施例中，多能细胞是人胚胎多能细胞。在一个实施例中，本专利技术涉及通过在包含激活素A或激活素C的培养基中培养胰腺内胚层细胞来增强生长抑素的表达同时抑制胰岛素、胰高血糖素和生长素释放肽的表达的方法。在一些实施例中，经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群表达的生长抑素比未经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群更多。在一些实施例中，与未经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群中胰岛素的表达相比，胰岛素的表达在经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群中受到抑制。在一些实施例中，与未经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群中胰高血糖素的表达相比，经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群中胰高血糖素的表达受到抑制。在一些实施例中，与未经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群中生长素释放肽的表达相比，生长素释放肽的表达在经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群中受到抑制。在一些实施例中，胰腺内胚层细胞基本上不表达CDX2或SOX2。在一些实施例中，经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞通过多能细胞的逐步分化获得。在一些实施例中，衍生出胰腺内胚层细胞的多能细胞是人胚胎多能细胞。在一个实施例中，本专利技术涉及通过在包含信号素3a或上皮细胞有丝分裂蛋白(Epigen)的培养基中处理胰腺内胚层细胞来增强NKX6.1的表达的方法。在一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强激素表达细胞中生长抑素的表达的方法，所述方法包括用激活素A或激活素C处理胰腺内胚层细胞。

【技术特征摘要】
2012.06.08 US 61/6571601.一种增强激素表达细胞中生长抑素的表达的方法，所述方法包括用激活素A或激活素C处理胰腺内胚层细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中胰岛素、胰高血糖素和生长素释放肽的表达受到抑制。3.根据权利要求1所述的方法，其中经激活素A或激活素C处理的所述胰腺内胚层细胞群表达的生长抑素比未经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群更多。4.根据权利要求3所述的方法，其中与未经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群中胰岛素的表达相比，胰岛素的表达在经激活素A或激活素C处理的所述胰腺内胚层细胞群中受到抑制。5.根据权利要求1所述的方法，其中与未经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群中胰高血糖素的表达相比，经激活素A或激活素C处理的所述胰腺内胚层细胞群中胰高血糖素的表达受到抑制。6.根据权利要求1所述的方法，其中与未经激活素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群中生长素释放肽的表达相比，所述生长素释放肽的表达在经激活...

【专利技术属性】
技术研发人员：A雷扎尼亚，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US