一种检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒、使用方法及应用技术

本发明专利技术公开一种检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒、使用方法及应用，属于生物医学技术领域。首次发现rs1047896多态位点影响T1蛋白表达并与冠心病相关，根据此发现提供了一种检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒，包括特异性引物对、特异性等位基因荧光探针等。该试剂盒以待检测样品细胞的基因组DNA为模板，采用试剂盒提供的引物和探针序列，确定rs1047896多态位点的基因型，然后根据提供的风险值预测冠心病的患病风险，可用于冠心病的预防和辅助诊断。

Kit for detecting rs1047896 polymorphism of T1 gene, application method and application thereof

The invention discloses a kit for detecting T1 gene rs1047896 polymorphic loci, a usage method and application, and belongs to the field of biomedicine technology. Rs1047896 polymorphic loci were first found to affect the expression of T1 protein and related to coronary heart disease. According to this discovery, a kit for detecting the rs1047896 polymorphic loci of the T1 gene, including specific primer pairs and specific allele fluorescent probes, was found. The kit uses the primers and probe sequences provided by the kit to determine the genotypes of the rs1047896 polymorphic loci by using the primers and probe sequences provided by the kit, and then predict the risk of coronary heart disease based on the risk values provided, and can be used for prevention and diagnosis of coronary heart disease (CHD).

【技术实现步骤摘要】
一种检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒、使用方法及应用
本专利技术涉及一种检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒、使用方法及应用，属于生物医学

技术介绍
心血管疾病是仅次于恶性肿瘤的第二号杀手，是造成死亡的主要原因之一。目前我国约有2.3亿人患冠心病、脑卒中、心力衰竭和高血压等心血管病。死于心血管病者每年近300万人。冠心病是主要的心血管疾病，找到这类疾病的早期预警标志物对于心血管疾病的预防有重要意义。目前单核苷酸多态(SNP)与冠心病之间的关联研究是寻找预测冠心病易感性的预警标志物的主要方法之一。SNP是指基因组DNA水平单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。SNP在正常人群广泛存在。人类无论种族在基因组DNA序列上超过99％的序列都是相同的，SNP是个体间的遗传差异的主要表现。SNP可以在染色体印迹、DNA修饰、RNA二级结构、蛋白空间结构等多个水平上影响基因的表达及活性。另外SNP遗传稳定性好，易于分析，因此SNP成为疾病预警的主要标志物。目前找到更多的与冠心病相关的SNP，对于未来冠心病的个体化医疗、精准医学有必要作用。近年来研究发现脑源性神经营养因子及其受体酪氨酸激酶受体B(TrkB)通路除了在中枢和外周神经元的生存、生长和维持中发挥重要作用外，也在心血管系统表达和发挥作用。研究表明该通路能促进心肌存活，促进胚胎发育中的血管生成以及成年心梗后的心肌内血管生成。我们的研究发现TrkB在人和小鼠的主动脉内皮中大量表达，通过促进内皮钙粘蛋白的合成维持内皮完整。我们以前的研究还发现不稳定心绞痛病人的血浆脑源性神经营养因子浓度显著低于对照组，而且高的血浆脑源性神经营养因子浓度指示低的急性心血管事件发生率和低的死亡率，提示该通路在冠心病的发病及预后中发挥重要作用。我们的这一结果引起美国心肺血研究所Framingham心脏研究中心主任VasanS.Ramachandran的兴趣，于是他领导了大样本的孟德尔随机临床研究(KaessBM，etal.JAmHeartAssoc.2015；4:e001544)，进一步证实了我们的结论，即脑源性神经营养因子通路与冠心病存在因果关系。T1蛋白是体内神经酪氨酸激酶受体2(NTRK2)的截短表达形式，是脑源性神经营养因子的另一种受体。T1与TrkB拥有相同的胞外域，但是却有不同的胞内域，缺少TrkB的胞内激酶区，因此能与TrkB竞争结合细胞外的脑源性神经营养因子，却不能活化细胞内分子通路。TrkB蛋白是胚胎发育期间高表达的脑源性神经营养因子受体；而在成年期，TrkB蛋白表达相比胚胎发育期间明显降低，而T1蛋白成为脑源性神经营养因子主要的受体表达形式。未来针对冠心病的个体化医疗迫切需要大量的与冠心病相关的SNP，我们前期研究曾发现影响TrkB蛋白表达水平的一个多态位点与冠心病相关，但目前尚没有关于T1多态位点与冠心病相关联的研究报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒、使用方法及应用，首次发现了一个影响T1蛋白表达的功能多态位点，该多态位点为rs1047896多态位点，位于T1mRNA的3′非翻译区(UTR)，而且该多态位点与冠心病相关，可用于预测冠心病的易感性和未来冠心病的个体化医疗。本专利技术的技术方案如下：一种检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒，包括以下试剂：10×PCR缓冲液，10mMdNTP混合液，5U/μLTaqDNA聚合酶，特异性引物对T1-F、T1-R，T等位基因荧光探针T1-T，C等位基因荧光探针T1-C，ddH2O；其中，特异性引物对分别在T1基因rs1047896多态位点的上游和下游设计，扩增产物对应基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，上游引物T1-F的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，下游引物T1-R的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；其中，等位基因荧光探针特异靶向rs1047896多态位点，T等位基因荧光探针T1-T的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA，C等位基因荧光探针T1-C的荧光报告基团为HEX，淬灭基团为TAMRA；T等位基因荧光探针T1-T的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，C等位基因荧光探针T1-C的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。上述试剂盒中10×PCR缓冲液、dNTP混合液、TaqDNA聚合酶均为市售产品。根据本专利技术优选的，所述检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒组成如下：100μL10×PCR缓冲液；100μL10mMdNTP混合液；50μLTaqDNA聚合酶，浓度5U/μL；50μLT1-F引物，浓度为10μM；50μLT1-R引物，浓度为10μM；50μL探针T1-T，浓度为10μM；50μL探针T1-C，浓度为10μM；500μLddH2O。一种检测T1基因rs1047896多态位点试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)提取待检测样品细胞的基因组DNA；(2)使用检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒，配制反应体系，采用实时定量PCR结合Taqman探针技术检测FAM通道和HEX通道荧光值；(3)将步骤(2)中检测的FAM通道和HEX通道荧光值代入Excel中制作散点图，其中沿着X轴分布的为TT基因型，沿着Y轴分布的为CC基因型，沿着对角线分布的为CT杂合子。根据本专利技术优选的，上述步骤(1)中待检测样品为体液，包括外周血，房水，羊水，腹水，心包液及胸腔积液。根据本专利技术优选的，上述步骤(2)中的反应体系为：10×PCR缓冲液2μL，10mMdNTP混合液2μL，5U/μLTaqDNA聚合酶1μL，10μMT1-F引物1μL，10μMT1-R引物1μL，10μM探针T1-T1μL，10μM探针T1-C1μL，基因组DNA2μL，ddH2O补足至20μL；实时定量PCR检测程序为：95℃预变性30秒；95℃变性0秒，60℃退火5秒，72℃延伸10秒，重复35个循环，每一次循环结束检测荧光；全部反应结束后检测荧光，用色彩补偿程序校正荧光值。上述试剂盒在预测冠心病易感性中的应用，包括如下步骤：(1)收集待检测样品，提取样品细胞的基因组DNA；(2)应用检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒，配制20μL反应体系，采用实时定量PCR结合Taqman探针技术检测FAM通道和HEX通道荧光值，确定rs1047896多态位点的基因型；(3)冠心病易感性预测：rs1047896多态位点的基因型TT纯合子较CC纯合子和CT杂合子患冠心病的风险显著增加，相对危险度为1.56。根据本专利技术优选的，上述步骤(1)中待检测样品为体液，可包括外周血，房水，羊水，腹水，心包液及胸腔积液。根据本专利技术优选的，上述步骤(2)中的实时定量PCR的20μL反应体系为：10×PCR缓冲液2μL，10mMdNTP混合液2μL，5U/μLTaqDNA聚合酶1μL，10μMT1-F引物1μL，10μMT1-R引物1μL，10μM探针T1-T1μL，10μM探针T1-C1μL，基因组DNA2μL，ddH2O补足至20μL；实时定量PCR的扩增程序为：95℃预变性30秒；95℃变性0秒，60℃退火5秒，72℃延伸10秒，重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒，包括以下试剂：10×PCR缓冲液，10mMdNTP混合液，5U/μL TaqDNA聚合酶，特异性引物对T1‑F、T1‑R，T等位基因荧光探针T1‑T，C等位基因荧光探针T1‑C，ddH2O；其中，特异性引物对分别在T1基因rs1047896多态位点的上游和下游设计，扩增产物对应基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，上游引物T1‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物T1‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，等位基因荧光探针特异靶向rs1047896多态位点，T等位基因荧光探针T1‑T的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA，C等位基因荧光探针T1‑C的荧光报告基团为HEX，淬灭基团为TAMRA；T等位基因荧光探针T1‑T的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，C等位基因荧光探针T1‑C的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒，包括以下试剂：10×PCR缓冲液，10mMdNTP混合液，5U/μLTaqDNA聚合酶，特异性引物对T1-F、T1-R，T等位基因荧光探针T1-T，C等位基因荧光探针T1-C，ddH2O；其中，特异性引物对分别在T1基因rs1047896多态位点的上游和下游设计，扩增产物对应基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，上游引物T1-F的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，下游引物T1-R的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；其中，等位基因荧光探针特异靶向rs1047896多态位点，T等位基因荧光探针T1-T的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA，C等位基因荧光探针T1-C的荧光报告基团为HEX，淬灭基团为TAMRA；T等位基因荧光探针T1-T的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，C等位基因荧光探针T1-C的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，10×PCR缓冲液、dNTP混合液、TaqDNA聚合酶均为市售产品。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒组成如下：100μL10×PCR缓冲液；100μL10mMdNTP混合液；50μLTaqDNA聚合酶，浓度5U/μL；50μLT1-F引物，浓度为10μM；50μLT1-R引物，浓度为10μM；50μL探针T1-T，浓度为10μM；50μL探针T1-C，浓度为10μM；500μLddH2O。4.一种检测T1基因rs1047896多态位点试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)提取待检测样品细胞的基因组DNA；(2)使用检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒，配制反应体系，采用实时定量PCR结合Taqman探针技术检测FAM通道和HEX通道荧光值；(3)将步骤(2)中检测的FAM通道和HEX通道荧光值代入Excel中制作散点图，其中沿着X轴分布的为TT基因型，沿着Y轴分布的为CC基因型，沿着对角线分布的为CT杂合子。5.如权利要求4所述的使用方法，其特征在于，步骤(1)中待检测样品为体液，包括外周血，房水，羊水，腹水，心包液及胸腔积液。6.如权利要求4所述的使用方法，其特征在于，步骤(2)中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜虹，刘彦，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：山东,37