本发明专利技术提供了一种先天性心脏病易感者筛选基因标志物及其应用和试剂盒，该基因标志物为MALAT1基因rs619586多态性位点。本发明专利技术从CHD患者与年龄性别等匹配的无CHD新生儿的血细胞中提取DNA，并且最终验证了功能性MALAT1基因rs619586位点单核苷酸多态性，以此作为CHD新型有效的生物标志物，操作简单，灵敏度高，为筛选CHD易感者提供依据。
Screening genetic markers for congenital heart disease susceptible persons and their application and kit
The present invention provides a screening gene marker and its application and kit for the susceptible people of congenital heart disease. The gene marker is MALAT1 gene rs619586 polymorphism site. This invention extracts DNA from the blood cells of the CHD patients and the non CHD newborns matched with age and sex, and finally verifies the single nucleotide polymorphisms of the functional MALAT1 gene rs619586 site, as a new and effective biomarker of CHD, which is simple and sensitive, and provides the basis for the screening of CHD susceptible.
【技术实现步骤摘要】
先天性心脏病易感者筛选基因标志物及其应用和试剂盒
本专利技术属于生物技术学领域，特别涉及一种用于先天性心脏病易感性筛选的生物标志物。
技术介绍
先天性心脏病(CHD)是新生儿常见的出生缺陷。出生伴有先天性心脏病的患病率约为8‰，但世界各地的人数差异很大。相比之下，成年人的CHD患病率为4‰。临床上，房间隔缺损(ASD)，室间隔缺损(VSD)，动脉导管未闭(PDA)，肺动脉瓣狭窄(PS)，法洛四联症(TOF)，大动脉转位(TGA)和主动脉狭窄(AoS)是CHD的常见亚型。CHD是导致儿童死亡的主要疾病之一，年死亡率约为1％，死亡病例通常在5岁以下。先天性心脏病源自于心脏或胸内大血管结构异常复杂后果。正如Corno等报道的那样，缺氧被认为是出生初期CHD的重要诱因；缺氧诱导因子(HIFs)是CHD中必不可少的转录因子和/或调节因子。基于这种分子机制，肺动脉高压(PAH)是一种与CHD相关的严重疾病，PAH-CHD通常与不良预后相关。现代分子生物学确定非编码RNAs(ncRNAs)参与了CHD的发病。ncRNAs可根据其长度进一步分为两类：长度小于200nt的非编码RNAs，包括microRNAs(miRNAs)，长度超过200nt的非编码RNAs，包括长的非编码RNA(lncRNAs)，对于lncRNAs在CHD发病机制中的作用还没有得到很多的探索和理解。转移相关的肺腺癌转录物1(Metastasis-associatedlungadenocarcinomatranscript1，MALAT1)是影响表观遗传调控和剪接的特殊lncRNA。在心脏疾病中，MALAT1调节心肌细胞和内皮细胞增殖，二者都是CHD发病的关键。据报道lncRNA中的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNPs)通过直接调控lncRNA表达来改变其相应lncRNA的功能。据报道，MALAT1的功能多态性与中国人群PAH易感性相关。考虑到MALAT1在心脏病中的重要作用以及SNPs的一般作用，我们对中国新生儿进行了病例对照研究，以确定和量化MALAT1多态性与CHD之间的关系。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种先天性心脏病易感者筛选基因标志物及其应用和试剂盒，为筛选CHD易感者提供依据。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种先天性心脏病易感者筛选基因标志物，该基因标志物为MALAT1基因rs619586多态性位点，如SEQIDNO:1所示。CTTCAAAAGGTGGTAAACTATACCT[A/G]CTGTCCCTCAAGAGAACACAAGAAG(SEQIDNO:1)上述的基因标志物在制备检测先天性心脏病易感者的试剂盒中应用。一种用于检测先天性心脏病易感者的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的MALAT1基因3rs619586扩增引物，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的MALAT1基因rs619586的分型引物：每个ID的产品同时包括逆转探针和PCR探针。有益效果：本专利技术从CHD患者与年龄性别等匹配的无CHD新生儿的血细胞中提取DNA，并且最终验证了功能性MALAT1基因rs619586位点单核苷酸多态性，以此作为CHD新型有效的生物标志物，操作简单，灵敏度高，为筛选CHD易感者提供依据。通过检测被测试者：MALAT1的rs619586位点中GG、AA及AG基因型，从而能判断其是否与中国人群CHD易感性相关。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述。本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的包含范围不限于下述的实施例。下面的实施例中未注明的条件和方法等均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。实施例：研究对象的选择本专利技术纳入了713例先天性心脏病患者和730例无先天性心脏病对照，均为1-28天新生儿和中国汉族遗传基因无关个体。参与者于2015年1月至2016年12月从昆山市第一人民医院及贵州医科大学附属医院招募。所有病例均经超声诊断。其他器官结构畸形或已知染色体异常或其他心脏相关疾病的患者被排除在外。对照组为年龄和性别匹配的健康新生儿，无先天性心脏病或其他疾病，属于同一地理区域，与对照同期出生。本专利技术按照“赫尔辛基宣言”的原则，经江苏大学昆山市第一人民医院伦理委员会批准(批准号：201705)。参与者的每位法定监护人在捐献5毫升新生儿静脉血之前签署了书面知情同意书，以便进一步调查和分析。参与者的人口统计学和临床特征也被记录下来。经江苏省疾病预防控制中心伦理委员会同意，所有研究对象均签署了相关的知情同意书，并授权参与本项目研究。静脉血采集及预处理及提取血样采集和前处理采集研究对象清晨空腹肘静脉血5.0ml，置于肝素钠自动静脉采血管中，充分摇匀后置于冰盒带回实验室。室温下800×g离心10min，分离血清和血细胞，血细胞用于提取基因组DNA。采用QIAamp96DNAQIAcubeHTKit试剂盒按照操作手册进行周围血细胞基因组DNA提取，以NanodropOneC超微量紫外分光光度计进行检测，结果显示:吸光度(A)260/A280在1.8-2.0之间，说明所提取的DNA纯度较高，可用于下一步实验。基因SNP分型统计学分析本专利技术中，采用SPSS23.0软件进行统计分析。采用χ2拟合优度检验来推导Hardy-Weinberg均衡(HWE)。在病例对照研究中，使用Student-t检验和/或χ2检验来证明病例组和对照组的人口和临床特征以及基因型频率如何不同。应用无条件单变量和多变量logistic回归来评估SNP的作用，并量化SNP与CHD之间的关联。调整比值比(OR)和95％置信区间(CIs)进行了计算。根据癌症基因组图谱(TCGA)SNP阵列基因型程序，最终用IMPUTEv2.3.2软件的辅助进行SNPs的插入，以千人组基因计划数据作为增补数据。血细胞基因SNP分型方法(1)DNA的提取采用QIAamp96DNAQIAcubeHTKit试剂盒按照操作手册进行周围血细胞基因组DNA提取，以NanodropOneC超微量紫外分光光度计进行检测。(2)SNP分型通过ABI7900实时PCR系统进一步进行基因分型程序。实时PCR的条件如下：95℃，10min；95℃，15s；60℃，1分钟(最后两个步骤为40个循环)。结果：研究对象的人口学及临床资料描述研究人群的基本特征列于表1.CHD患者与对照组的年龄和性别比较，差异无统计学意义(P＝0.819，P＝0.651)，表明这两个因素在这项研究中很匹配。在父母特征方面，CHD组和对照组父亲年龄差异无统计学意义(28.6±4.9vs.29.1±5.1，P＝0.058)，母亲年龄差异有统计学意义(P<±5.4vs.28.5±5.2，P＝0.032)。CHD病例组与对照组父母的慢性疾病病史差异无统计学意义(P＝0.724)。CHD组的母亲们在怀孕期吸烟(P＝0.042)或喝酒(P＝0.023)多于对照组。表1先天性心脏病病例和对照的特征和选择变量CHD＝先天性心脏病MALAT1SNPs与CHD风险之间的关联根据上述标准选择MALAT1中的三个候选SNP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种先天性心脏病易感者筛选基因标志物，其特征在于：该基因标志物为MALAT1基因rs619586多态性位点。
【技术特征摘要】
1.一种先天性心脏病易感者筛选基因标志物，其特征在于：该基因标志物为MALAT1基因rs619586多态性位点。2.权利要求1所述的基因标志物在制备检测先天性心脏病易感者的试剂盒中应用。3.一种用于检测先天性心脏病易...
【专利技术属性】
技术研发人员：李倩，王华，朱文英，吴义平，袁玉峰，张海燕，李洁，
申请(专利权)人：昆山市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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