一种环境化学物心肌发育毒性评价技术方法技术

本发明专利技术属于环境化学物毒性评价技术领域，具体提供一种基于转录组测序技术分析环境化学物对人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞毒性的评价技术方法。本发明专利技术提供的人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞的方案，可以用于进行环境接触剂量或人群内暴露剂量下的环境化学物的心肌发育毒性筛查，通过本发明专利技术优化的人胚胎干细胞定向心肌细胞分化模型，可以构建环境化学物暴露致胚胎心肌发育毒性的风险评估体系，在环境化学物、药物等心肌毒性预测评估上得以推广应用，为CHD的早期预防提供理论依据，为促进儿童健康、提高人口质量做出贡献。且本发明专利技术所采用的转录组测序，可以从全基因组水平，明确环境化学物暴露所导致的胚胎心肌发育毒性。

A method for evaluating the developmental toxicity of environmental chemicals

The present invention belongs to the technical field of environmental chemical toxicity evaluation, and specifically provides a technique for evaluating the toxicity of human embryonic stem cells into cardiomyocytes based on the analysis of the environmental chemicals. The present invention provides a scheme for directionally induced differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocytes, which can be used to screen the myocardial developmental toxicity of environmental chemicals under environmental exposure doses or exposure doses within the population. The environmental chemical storm can be constructed through the optimized human embryonic stem cell oriented cardiomyocyte differentiation model. The risk assessment system for the developmental toxicity of embryonic myocardium has been applied in the assessment of environmental chemicals and drugs, and provides a theoretical basis for the early prevention of CHD, and contributes to promoting the health of children and improving the quality of the population. Moreover, transcriptome sequencing can be used to identify embryonic developmental toxicity of myocardium induced by exposure to environmental chemicals at the genome level.

【技术实现步骤摘要】
一种环境化学物心肌发育毒性评价技术方法
本专利技术属于环境化学物毒性评价
，具体涉及是一种基于转录组测序技术分析环境化学物对人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞毒性的评价技术方法。
技术介绍
先天性心脏病(CHD)简称先心病，是最常见的出生缺陷，我国新生儿发病率为0.6％-0.8％，在各种出生缺陷中占首位。我国每年有超过20万CHD患儿出生，为社会和家庭带来沉重的负担。CHD是由于心脏、血管在胚胎发育过程中的障碍所导致的心脏、血管结构和功能上的异常，可严重危害婴幼儿的健康，导致宫内流产、死胎等发生，不但影响胎儿出生后的生活质量,而且降低成年期的生存质量。孕期的前三个月是胚胎发育的重要阶段，其中心脏是机体各系统发生过程中首先形成的器官，心脏的形成开始于胚胎期第2周，至第8周房室间隔完全形成，因此第2-8周是胚胎心脏发育的关键时期，此阶段是CHD形成的风险时期。导致CHD的原因非常复杂，少数是由于染色体异常等遗传因素所致，除此之外约80％的病因和发病机制不明确，目前一致认为是环境、基因等相互作用的结果。近年来国内外学者开始给予环境因素更多的关注，在胚胎心脏发育的敏感期内，心脏对胚胎发育环境中的变化高度敏感，孕妇暴露于不良环境因素中，胎儿可能出现心血管畸形等出生缺陷。环境化学物是一类与CHD有关的重要环境因素，外源性的化学物可通过胎盘屏障进入胎儿体内，影响胎儿的正常发育。胚胎发育是遗传信息和环境因素相互作用产生特异表型的编程过程，胚胎从无限分化潜能的全能干细胞分化形成机体不同的组织和器官。胚胎干细胞(ESC)是检测环境化学物对胚胎心肌发育影响的良好模型。ESC是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能。ESC可分化成心脏组织的多种类型细胞，包括心房肌、心室肌、房室结、蒲肯野氏细胞和窦房结样细胞等多种心肌组织细胞。ESC分化的心肌细胞和胎儿形成早期的心肌细胞在电生理、钙运作、肌原纤维结构和心肌收缩蛋白的表达等各个方面都有很大的相似性。这些特性赋予了ESC在研究心肌细胞发生发育分子机制中的重要价值，也为药物、化学物的心脏毒性检测提供了独特的模型。外源性化学物暴露可以造成心肌分化过程中相关基因发生改变，但此方面的研究还主要停留在单基因的层面，缺乏全基因组的探讨。转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合，转录组研究能够从整体水平研究基因功能,揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。RNA-Seq作为一种高效、快捷的转录组研究手段被广泛应用于各项研究中。因此，迫切需要通过高通量测序方法，检测低剂量的环境化学物暴露所致的胚胎心肌发育相关的转录组变化，这对于揭示环境外源化学物暴露导致的心肌发育毒性及其机制探讨有重要价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高通量测序方法，以检测低剂量的环境化学物暴露所致的胚胎心肌发育相关的转录组变化，揭示环境外源化学物暴露导致的心肌发育毒性并及其机制探讨提供依据。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种环境化学物对胚胎心肌发育毒性的评价技术方法，包括如下步骤：(1)在GSK抑制剂、Wnt抑制剂的作用下优化人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞；(2)在干细胞向心肌细胞诱导分化的全程中，接受低剂量的环境化学物暴露；(3)在环境化学物暴露中，采集细胞照片和心肌细胞搏动视频，通过比较对照组和环境化学物处理组的荧光值和搏动速率来分析环境化学物处理对心肌分化效率的影响；(4)收集经过纯化后的对照组和处理组的心肌细胞，提取RNA，利用RNA-seq检测转录组表达水平，比较环境化学物处理组和对照组的基因表达差异；(5)采用荧光定量PCR检测筛选出的关键心肌特异性差异基因的表达水平，验证环境化学物对心肌细胞分化的影响。优选的，所述步骤(1)具体方法为：将人胚胎干细胞系H9采用条件型培养基mTeSR1培养；后将H9细胞消化成单细胞，在mTeSR1中培养四天后，开始诱导分化；采用添加了GSK3抑制剂CHIR99021、不含胰岛素的RPMI/B27培养液培养，然后用不含胰岛素的RPMI/B27培养液培养；之后更换诱导液，用含有Wnt抑制剂IWR-1、不含胰岛素的RPMI/B27培养基培养，然后更换为不含胰岛素的RPMI/B27培养基继续培养；诱导分化的第7天开始，采用RPMI/B27培养液培养。优选的，所述步骤(2)中的低剂量为环境接触剂量或人群内暴露剂量；所述的暴露为连续暴露3周。优选的，所述的步骤(4)具体方法为：使用QiagenRNeasyMiniKit提取RNA；通过使用TruSeqRNALibraryPrepKit对RNA进行建库测序；测序后所得数据进行质控后，使用STAR2.0进行序列比对，以H19作为参考基因组，进行转录组组装及数目计算；通过DEseq2比较处理组与对照组的基因表达差异。优选的，所述环境化学物为三氯生。本专利技术的有益效果(1)本专利技术提供的人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞的方案，可以用于进行环境接触剂量或人群内暴露剂量下的环境化学物的心肌发育毒性筛查。通过本专利技术优化的人胚胎干细胞定向心肌细胞分化模型，可以构建环境化学物暴露致胚胎心肌发育毒性的风险评估体系，在环境化学物、药物等心肌毒性预测评估上得以推广应用，为CHD的早期预防提供理论依据，为促进儿童健康、提高人口质量做出贡献。(2)本专利技术采用的转录组测序，可以从全基因组水平，明确环境化学物暴露所导致的胚胎心肌发育毒性，通过本专利技术方法系统的筛选，发现了一组化学物致胚胎心肌发育毒性的敏感指标，具体包括NKX2.5、TBX20、MEF2C、MEF2A、ISL1、MYL2、cTnT、cTnI等，可以作为化学物暴露致CHD的候选生物学标志。附图说明图1为人胚胎干细胞H9向心肌细胞的分化过程图2为TCS处理对心肌细胞形态的影响图3为TCS处理组和对照组中心肌细胞特异性标志物的免疫荧光检测图4为TCS处理对分化形成的心肌细胞搏动频率的影响图5为TCS处理后转录组测序结果图6为心肌特异性差异基因的基因表达验证具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料，试剂，如无特殊说明，均可从商业购买。实施例1人胚胎干细胞系H9定向心肌细胞分化的方法人胚胎干细胞系H9细胞(购买于中国科学院干细胞库)，复苏在细胞外基质Matrigel(体积分数为1％)包被的六孔培养板中，复苏时采用含有5μMROCK抑制剂Y27632的mTeSR1培养基培养，置于37℃、5％CO2条件下培养。复苏第二天更换为mTeSR1培养基培养，细胞生长至约80％左右，每孔添加消化酶消化成单细胞，用于后续的分化。计数0.5×106个细胞接种到Matrigel包被的12孔培养板中，添加含有5μMROCK抑制剂Y27632的mTeSR1培养基培养24小时。继续采用mTeSR1培养基培养72小时，每天换液。分化第0天，采用不含胰岛素的RPMI/B27培养基培养，其中添加12μM的GSK3抑制剂CHIR99021，培养24小时，然后更换为不含胰岛素的RPMI/B27培养基继续培养72小时(期间每24小时需要换液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环境化学物对胚胎心肌发育毒性的评价技术方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在GSK抑制剂、Wnt抑制剂的作用下优化人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞；(2)在干细胞向心肌细胞诱导分化的全程中，接受低剂量的环境化学物暴露；(3)在环境化学物暴露中，采集细胞照片和心肌细胞搏动视频，通过比较对照组和环境化学物处理组的荧光值和搏动速率来分析环境化学物处理对心肌分化效率的影响；(4)收集经过纯化后的对照组和处理组的心肌细胞，提取RNA，利用RNA‑seq检测转录组表达水平，比较环境化学物处理组和对照组的基因表达差异；(5)采用荧光定量PCR检测筛选出的关键心肌特异性差异基因的表达水平，验证环境化学物对心肌细胞分化的影响。

【技术特征摘要】
1.一种环境化学物对胚胎心肌发育毒性的评价技术方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在GSK抑制剂、Wnt抑制剂的作用下优化人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞；(2)在干细胞向心肌细胞诱导分化的全程中，接受低剂量的环境化学物暴露；(3)在环境化学物暴露中，采集细胞照片和心肌细胞搏动视频，通过比较对照组和环境化学物处理组的荧光值和搏动速率来分析环境化学物处理对心肌分化效率的影响；(4)收集经过纯化后的对照组和处理组的心肌细胞，提取RNA，利用RNA-seq检测转录组表达水平，比较环境化学物处理组和对照组的基因表达差异；(5)采用荧光定量PCR检测筛选出的关键心肌特异性差异基因的表达水平，验证环境化学物对心肌细胞分化的影响。2.根据权利要求1所述的评价技术方法，其特征在于，所述步骤(1)具体方法为：将人胚胎干细胞系H9采用条件型培养基mTeSR1培养；后将H9细胞消化成单细胞，在mTeSR1中培养四天后，开始诱导分化；采用添加了GSK3抑制剂CHIR9902...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜桂珍，秦玉峰，陆春城，宋玲，夏彦恺，王心如，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32