人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，扩增引物为，一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第7外显子的共用引物、一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第8外显子的共用引物、一对特异性扩增内参基因CFTR基因的特异性引物；所述的荧光探针为，特异性检测SMN1基因第7外显子的荧光探针、特异性检测SMN1基因第8外显子的荧光探针、特异性检测SMN2基因第7外显子的荧光探针、特异性检测SMN2基因第8外显子的荧光探针、特异性检测内参基因CFTR基因的荧光探针。针对目前人运动神经元基因拷贝数定量检测方法存在的问题与不足，提供一种检测快速、简便，检测结果可靠的用于人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒。

Fluorescence quantitative PCR kit for detection of gene copy number of human spinal muscular atrophy

The present invention discloses a fluorescent quantitative PCR kit for detecting the gene copy number of human spinal muscular atrophy, including amplification primers and fluorescent probes, amplification primers, a common primer for a pair of specific amplification of SMN1 and SMN2 exons, a common primer for a pair of specific amplification SMN1 and SMN2 gene eighth exons, and one pair of primers, one pair of specific primers, one pair of specific amplification and the common primers of the exon of SMN2 gene, and one pair of primers, one pair of specific primers and a common primer for the exon of the SMN2 gene, and the same primers for the specific amplification of the exon of the SMN2 gene and the common primers of the exon of the SMN2 gene, Specific primers for the specific amplification of the CFTR gene of the internal reference gene; the fluorescence probe is specific to detect the fluorescence probe of the exon of the SMN1 gene seventh, the specific detection of the fluorescence probe of the exon of the SMN1 gene eighth, the specific detection of the fluorescence probe of the exon seventh of the SMN2 gene, and the specific detection of the exon of the SMN2 gene eighth. Fluorescence probe and specific fluorescent probe for detecting CFTR gene of internal reference gene. In view of the problems and shortcomings of the current quantitative detection method of human motoneuron gene copy number, a fast, simple and reliable detection result is used to detect the copy number of the pathogenic gene of human spinal muscular atrophy by fluorescence quantitative PCR kit.

【技术实现步骤摘要】
人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，具体来说，涉及一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒。
技术介绍
脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy，SMA)是一组较为常见的常染色体隐性遗传病，是由于脊髓前角细胞运动神经元退化变性所导致的神经肌肉疾病。临床表现为进行性、对称性肌无力、肌萎缩和瘫痪。新生儿发病率为1/6000～1/10000，在正常人群中致病基因携带者的发生率为1/40～1/80。SMA为致死性疾病，神经肌肉疾病病情严重，目前临床上无有效治疗手段。脊髓性肌萎缩症国际协会根据SMA患者的发病年龄和临床表现分为4型：Ⅰ型(又称Werding-Hoffman病)是最严重的亚型(重型)，约占SMA患者的一半，发病急、进展快，一般在出生6个月之内发病，表现为严重的全身肌无力和肌张力降低，不能独坐或走，多于2岁内死于呼吸肌麻痹；II型为慢性婴儿型(中间型)，出生后6～18个月间发病，患儿可独坐，但不能独立站立和行走，大多能存活2年以上；III型(又称Kugelberg-Welander病)为青少年型(轻型)，出生18个月后才发病，病情发展缓慢，多数仅表现有肌力弱，可以保持独立行走和站立的能力，一般在成年后死亡。Ⅳ型则为成年型(极轻型)，一般于20～30岁以后发病，主要表现为缓慢逐渐发生的上下肢近端无力和肌肉萎缩，成年期都能够行走。研究发现，定位于染色体5q11.2～13.3区域的运动神经元存活基因(survivalmotorneurongene，SMN)是SMA发病的决定性基因。SMN基因全长20kb，含8个外显子，其转录产物约1700bp，编码294个氨基酸。该基因在5号染色体上有2种拷贝，在端粒侧的称为SMN1，在着丝粒侧的称SMN2，两者间具有高度的同源性，仅有5个碱基的差异分别位于第7、8外显子和第6、7内含子中。SMA发病主要是由于SMN1基因发生缺失、点突变等基因异常所致。研究表明，SMN1基因是SMA的致病基因，大多数(90.0％以上)SMA患者有SMN1基因第7和(或)第8外显子的纯合缺失突变；而SMN2基因是SMA症状轻重的调节基因，其拷贝数与SMA病情的严重程度有关，轻型SMA患者通常比重型SMA具有更多的SMN2拷贝数，即SMN2能在一定程度上弥补SMN1缺失所造成的功能缺陷。由于SMA属于染色体隐性遗传病，若夫妻皆为SMA致病基因携带者，则胎儿无论男女皆有1/4的概率为SMA患者，1/2的概率为SMA致病基因携带者，另1/4的概率为正常。因此，筛查具有SMA家族病史者的SMA致病基因存在状态，对夫妻双方均为SMA致病基因携带者的胎儿进行产前诊断，对于预防SMA患儿出生、推进优生优育、提高人口素质具有重要意义。临床上对SMA的辅助分子检测，目前常用的方法有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法，即PCR-RFLP法。该方法利用SMN1基因和SMN2基因在第7和第8外显子上2个碱基差别区分SMN1和SMN2，检测SMN1外显子7，8的纯合缺失确定SMA诊断。但该方法无法对SMN1基因杂合缺失进行检测，不能区分SMA携带者和正常人及杂合缺失SMN1基因的SMA患者。另一常用的方法是多重连接探针扩增技术，即MPLA法。2002年荷兰的Schouten等设计专利技术了MLPA技术，该技术是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术，仅需少量的DNA，即可通过变性、杂交、连接、PCR扩增及毛细管电泳步骤，在同一反应管中对几十个不同的靶基因进行检测和定量分析。与以往的检测技术相比，该技术可对待检测基因的所有外显子进行缺失、重复等异常改变进行全面检测。虽然MLPA法能够检测到SMN1基因的纯合突变和杂合突变，但是该方法学实验步骤较为繁琐，操作过程中容易出现失误导致实验失败。而且该方法学要在PCR反应结束后，开管对PCR产物进行后处理，在操作过程中易发生实验室污染。目前MLPA法进行SMA的分子检测，多采用荷兰MRC公司的MLPA检测试剂盒，该方法试剂成本较高，需要特定的分析仪器(基因测序仪，价格昂贵)，耗时长(从DNA提取完成到数据分析得到结果至少需要2个工作日)，难以在临床上进行大规模人群筛查和技术推广。近年来，已有学者在研究基于实时荧光定量聚合酶链式反应技术的SMA检测方法，即Real-TimePCR法。Real-TimePCR法可有效应用于SMA致病基因拷贝数检测，其最大优点是可对基因拷贝数进行定量分析，且实验过程操作简便快捷，可有效避免PCR产物遗留污染。然而对目前采用Real-TimePCR技术进行SMA检测的一些文献进行分析发现，这些技术均大部分是基于SMN1与SMN2基因间的有限核苷酸差异(第7外显子与第8外显子各有一个核苷酸的差异)，采用传统的扩增阻抗原理设计相应的引物与探针。以第7外显子为例，即将SMN1基因与SMN2的差异碱基置于PCR引物3’端最后一位(SMN1第7外显子为C，SMN2第7外显子为T)，而检测探针采用SMN1与SMN2公用探针。然而，研究表明，这样的设计并不足以有效区别SMN1第7外显子和SMN2第7外显子。从而使对SMN1或SMN2基因拷贝数的相对定量出现偏差，影响其结果的临床参考价值。Real-TimePCR法的另一设计策略是，依据SMN1与SMN2的差异碱基(如第7外显子的C和T、第8外显子的G和A)，在差异碱基位置设计特异性的探针，但这一设计无法避免的是SMN1与SMN2的PCR扩增引物将是公用的。大样本的研究表明，在携带者群体中，SMN2基因拷贝数可多达4个以上，对于只有1个拷贝SMN1的携带者而言，当SMN1与SMN2采用公用引物进行扩增时，将无法避免多拷贝SMN2基因优势扩增对单拷贝SMN1基因的影响(因为此时二者的PCR引物相同)，同样会导致相对定量结果的偏差。随着以降低SMA患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施，以及SMA发病分子机制及分子流行病学的深入研究，开发准确可靠、简单实用、能够实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的快速检测SMN1基因拷贝数，从而确诊SMA的新型分子诊断试剂盒为当前迫切之需。针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本发针对目前人运动神经元基因拷贝数定量检测方法存在的问题与不足，提供一种检测快速、简便，检测结果可靠的用于人类脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测的荧光定量PCR试剂盒。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，所述的扩增引物为，一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第7外显子的共用引物、一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第8外显子的共用引物、一对特异性扩增内参基因CFTR基因的特异性引物；所述的荧光探针为，特异性检测SMN1基因第7外显子的荧光探针、特异性检测SMN1基因第8外显子的荧光探针、特异性检测SMN2基因第7外显子的荧光探针、特异性检测SMN2基因第8外显子的荧光探针、特异性检测内参基因CFTR基因的荧光探针；其中，所述的一对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其特征在于，所述的扩增引物为，一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第7外显子的共用引物、一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第8外显子的共用引物、一对特异性扩增内参基因CFTR基因的特异性引物；所述的荧光探针为，特异性检测 SMN1 基因第7外显子的荧光探针、特异性检测 SMN1基因第8外显子的荧光探针、特异性检测SMN2基因第7外显子的荧光探针、特异性检测SMN2基因第8外显子的荧光探针、特异性检测内参基因CFTR基因的荧光探针；其中，所述的一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第7外显子的共用引物中，上游引物SMN‑EX7‑F和下游引物SMN‑EX7‑R序列分别如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示；所述的一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第8外显子的共用引物中，上游引物SMN‑EX8‑F和下游引物SMN‑EX8‑R序列分别如SEQ NO.3和SEQ NO.4所示；所述的一对特异性扩增内参基因CFTR基因的引物中，上游引物CFTR‑F和下游引物CFTR‑R序列分别如SEQ NO.5和SEQ NO.6所示；所述的特异性检测SMN1基因第7外显子的荧光探针SMN1‑EX7‑P的序列如SEQ NO.7所示；所述的特异性检测SMN1基因第8外显子的荧光探针SMN1‑EX8‑P的序列如SEQ NO.8所示；所述的特异性检测SMN2基因第7外显子的荧光探针SMN2‑EX7‑P的序列如SEQ NO.10所示；所述的特异性检测SMN2基因第8外显子的荧光探针SMN2‑EX8‑P的序列如SEQ NO.11所示；所述的特异性检测内参基因CFTR基因的荧光探针CFTR‑P的序列如SEQ NO.9所示。...

【技术特征摘要】
1.一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其特征在于，所述的扩增引物为，一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第7外显子的共用引物、一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第8外显子的共用引物、一对特异性扩增内参基因CFTR基因的特异性引物；所述的荧光探针为，特异性检测SMN1基因第7外显子的荧光探针、特异性检测SMN1基因第8外显子的荧光探针、特异性检测SMN2基因第7外显子的荧光探针、特异性检测SMN2基因第8外显子的荧光探针、特异性检测内参基因CFTR基因的荧光探针；其中，所述的一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第7外显子的共用引物中，上游引物SMN-EX7-F和下游引物SMN-EX7-R序列分别如SEQNO.1和SEQNO.2所示；所述的一对特异性扩增SMN1和SMN2基因第8外显子的共用引物中，上游引物SMN-EX8-F和下游引物SMN-EX8-R序列分别如SEQNO.3和SEQNO.4所示；所述的一对特异性扩增内参基因CFTR基因的引物中，上游引物CFTR-F和下游引物CFTR-R序列分别如SEQNO.5和SEQNO.6所示；所述的特异性检测SMN1基因第7外显子的荧光探针SMN1-EX7-P的序列如SEQNO.7所示；所述的特异性检测SMN1基因第8外显子的荧光探针SMN1-EX8-P的序列如SEQNO.8所示；所述的特异性检测SMN2基因第7外显子的荧光探针SMN2-EX7-P的序列如SEQNO.10所示；所述的特异性检测SMN2基因第8外显子的荧光探针SMN2-EX8-P的序列如SEQNO.11所示；所述的特异性检测内参基因CFTR基因的荧光探针CFTR-P的序列如SEQNO.9所示。2.根据权利要求1所述的一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的特异性检测SMN1基因第7外显子的荧光探针SMN1-EX7-P，其5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为MGB-NFQ；所述的特异性检测SMN1基因第8外显子的荧光探针SMN1-EX8-P，其5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为MGB-NFQ；所述的特异性检测SMN2基因第7外显子的荧光探针SMN2-EX7-P，其5’端的荧光基团为NED，其3’端的荧光淬灭基团为MGB-NFQ；所述的特异性检测SMN2基因第8外显子的荧光探针SMN2-EX8-P，其5’端的荧光基团为NED，其3’端的荧光淬灭基团为MGB-NFQ；所述的特异性检测内参基因CFTR基因的荧光探针CFTR-P，其5’端的荧光基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为MGB-NFQ。3.根据权利要求1所述的一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂、SMN1基因0拷贝质控品、SMN1基因1拷贝质控品、SMN2基因0拷贝质控品和SMN2基因1拷贝质控品。4.根据权利要求3所述的一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括：PCR反应缓冲液、dNTPs、氯化镁、DNA聚合酶、UNG酶。5.根据权利要求3所述的一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述SMN1基因1拷贝质控品为含2拷贝CFTR基因序列与1拷贝SMN1基因序列的质粒DNA溶液；所述所述SMN2基因1拷贝质控品为含2拷贝CFTR基因序列与1拷贝SMN2基因序列的质粒DNA溶液。6.根据权利要求3所述的一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏星，孙喆，张可欣，贾玮，
申请(专利权)人：北京华瑞康源生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11