β-丙氨酸的生物合成方法技术

本发明专利技术公开了β‑丙氨酸的生物合成方法，包括重组酿酒酵母全细胞催化L‑天门冬氨酸转化合成β‑丙氨酸的反应；其中所述的重组酿酒酵母含有外源性L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶编码基因。本发明专利技术所述方法和应用，具有原材料廉价易得、操作简便易控、合成途径绿色高效、生物安全性好、反应速率快、转化率高等优势，为β‑丙氨酸的工业化生产奠定了基础。

Biosynthesis of beta alanine

The invention discloses the biosynthesis method of beta alanine, including the reaction of recombinant Saccharomyces cerevisiae whole cell to catalyze the conversion of L aspartic acid to beta alanine, and the recombinant Saccharomyces cerevisiae contains the encoding gene of exogenous L aspartic acid decarboxylase. The method and application of the invention have the advantages of cheap and easy to obtain raw materials, simple and easy to control operation, green and efficient synthesis way, good biological safety, fast reaction rate and high conversion rate, which lays the foundation for the industrialization of beta alanine.

【技术实现步骤摘要】
β-丙氨酸的生物合成方法
本专利技术涉及一种简洁、高效的β-丙氨酸微生物合成方法，尤其涉及应用重组基因工程酵母菌生物转化合成β-丙氨酸的方法，属于生物

技术介绍
β-丙氨酸，又称3-氨基丙酸，是自然界中唯一存在的β型氨基酸。β-丙氨酸在医药、食品、美容、饲料及化工等领域的应用广泛，如合成泛酸钙、肌肽、帕米膦酸二钠、巴柳氮等医药或饲料及食品添加剂。目前β-丙氨酸的生产主要有化学合成以及生物法，化学法应用更早且使用更为普遍，但往往存在污染严重、副反应(产物)多、晶体纯度不高等缺点；而生物酶法则具有底物选择性高、转化率高、且反应过程简单、产物晶体易提纯等优点，近年来受到广泛关注。专利CN105543119A中从葡萄园筛选到一株L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌株，其分类命名为特基拉芽孢杆菌PanD37(BacillustequilensisPanD37)，β-丙氨酸产量为16.25g/L，远低于目前工业化水平。直接从天然菌株中筛选高产L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌株比较困难，因此通过基因工程的方法来提高该酶的活性成了使其应用的唯一方法。专利CN101210230A中将大肠杆菌中的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因克隆并进行异源表达，并利用全细胞直接进行催化合成β-丙氨酸，但其反应是在细胞内进行，产量仅2.94g/L，离实际应用还有很大距离。专利CN106755155A和CN104531796A则采用细胞破碎后的酶液进行催化反应，催化效率相比采用全细胞时有所加快，说明采用全细胞进行合成时存在较大的底物进入细胞及产物扩散到胞外的阻力。从目前的报道来看大部分基因工程菌的宿主菌株都是以大肠杆菌为主，但大肠杆菌并非公认的生物安全菌种，在使用过程中存在内毒素污染等生物安全风险，且细胞破碎又会增加分离纯化成本。2015年邓思颖等研究了L-天冬氨酸-α-脱羧酶的酶学性质，不同来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶的稳定性并不理想，反应温度越高，反应速率越快，酶活损失也越大，这对于该酶的工业化生产是不利的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一套完整的生物转化生产β-丙氨酸的技术方案，期望通过基因工程及细胞表面展示的方法构建重组工程菌，并据其设计合理的生物发酵工程方案，以实现β-丙氨酸绿色、高效、低成本的工业化生产。为实现上述目的，本专利技术首先将外源性基因克隆后连接至表达载体，然后将所构建的重组载体转入作为表达宿主的酿酒酵母细胞，通过酵母细胞的培养使酶表达于酵母细胞的表面。基于此，本专利技术提供β-丙氨酸的生物合成方法，包括重组酿酒酵母全细胞催化L-天门冬氨酸转化合成β-丙氨酸的反应；其中所述的重组酿酒酵母含有外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因。本专利技术的方法不但可以克服底物和产物的跨膜阻力，且不需要酶的分离步骤，同时发现，将该酶表达于细胞表面后，该酶的稳定性得到了提升，催化过程中酶活更加稳定，不易失活。基于此，本专利技术再一方面的目的还在于提供一种β-丙氨酸的生物合成方法，该方法中包括使用上述本专利技术的重组酿酒酵母对底物的转化反应的步骤。本专利技术成功构建重组酿酒酵母细胞，使其作为全细胞催化剂将底物转化为β-丙氨酸，省去了酶的分离纯化，避免了内毒素的隐患及抗生素的使用，具有摩尔转化率高、生产速率快、酶的稳定性强等特点，是实现高效、环保、经济化生产β-丙氨酸的良好选择。附图说明本专利技术附图7幅，其中：图1是重组载体结构示意图。图2是重组酿酒酵母表面展示酶的荧光标记及激光共聚焦图像；其中A-1是白光照射下荧光倒置显微镜验证结果；A-2是493nm激发波长下荧光倒置显微镜验证结果；B-1是白光照射下激光共聚焦显微镜验证结果；B-2是493nm激发波长下激光共聚焦显微镜验证结果。图3是pH对重组酿酒酵母表面酶活性的影响试验结果。图4是不同方式的酶催化对比试验结果。图5是不同温度条件下酶活检测试验结果。图6是不同温度条件下重组酿酒酵母催化合成β-丙氨酸的试验结果。图7是重组酿酒酵母重复利用过程中表面酶活性检测试验结果。具体实施方式在现有技术的基础上，本专利技术首先将目的基因(核苷酸序列如SEQIDNO.1)和表达载体pYD1酶切后，经重组构建重组载体。然后，将重组载体转化至大肠杆菌DH5α中，具体方法可举例但不限于热击法。继而利用氨苄青霉素抗性基因筛选、PCR及酶切验证上述步骤所获得的转化子，保存于斜面培养基。为了获得所需的重组酵母细胞，需提取重组表达载体，并转化至酿酒酵母感受态细胞中，利用缺陷型筛选获得阳性转化子。将阳性转化子活化后接种到种子培养基，待菌体生长至OD620＝1.0～5.0时，转接至诱导培养基中，获得重组酿酒酵母。原则来讲，上述酿酒酵母感受态细胞包括所有根据现有技术可作为转化宿主的酿酒酵母感受态细胞。本专利技术具体实施方式中，所述的表达宿主是酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeEBY100。选择该宿主的突出原因之一，是可以利用酵母细胞表面展示技术，使酶蛋白与酵母细胞壁蛋白融合，以天然构象的形式锚定在细胞表面，相当于酶的固定化。同其余的宿主表达相比，展示酶制备简单，省去了酶的分离纯化以及固定化等步骤，有助于降低酶制剂生产成本。与胞内酶相比，展示酶无底物及产物的跨膜阻力，并且增强了酶的稳定性。如无特殊说明，本专利技术中所述及的斜面培养基配方如下：酵母浸粉5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，NaCl10.0g/L，琼脂粉20.0g/L，121℃灭菌15min，冷却后加入终浓度为10～100μg/mL的氨苄青霉素。所述的种子培养基配方如下：在82mL超纯水中，加入无氨基酵母氮源0.67g，如为制备固体培养基加入3.0g/L的琼脂粉，121℃灭菌15min；灭菌后补加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，组氨酸(2.0g/L)1mL，苏氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％葡萄糖5mL；所述的诱导培养基配方如下：在82mL超纯水中，加入无氨基酵母氮源0.67g，121℃灭菌15min；灭菌后补加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，组氨酸(2.0g/L)1mL，苏氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％半乳糖5mL；上述种子及诱导培养基的制备中所述及的氨基酸混合液中含有如下组分：精氨酸0.2g/L、天冬氨酸1.0g/L、谷氨酸1.0g/L、异亮氨酸0.3g/L、赖氨酸0.3g/L、缬氨酸1.5g/L、蛋氨酸0.2g/L、苯丙氨酸0.5g/L、丝氨酸3.75g/L、酪氨酸0.3g/L和腺嘌呤0.4g/L。在此基础上，本专利技术进一步提供一种β-丙氨酸的生物合成方法，该方法在于使用上述本专利技术的重组酿酒酵母全细胞催化L-天门冬氨酸转化合成β-丙氨酸的反应；其中所述的重组酿酒酵母含有外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因。其中所述及的外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因具有SEQIDNO.1所述的核苷酸序列，作为外源基因载体的酿酒酵母优选酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeEBY100。β-丙氨酸的生物合成是一项相对成熟的技术，反应体系中的底物浓度按照反应效率设置最有利于生产，反应底物浓度无上下限设置，但最高反应物浓度在一定程度上决定于反应底物在体系中的溶解度，并且随着反应底物浓度的增加，对转化本文档来自技高网...

【技术保护点】
β‑丙氨酸的生物合成方法，包括重组酿酒酵母全细胞催化L‑天门冬氨酸转化合成β‑丙氨酸的反应；其中所述的重组酿酒酵母含有外源性L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶编码基因。

【技术特征摘要】
1.β-丙氨酸的生物合成方法，包括重组酿酒酵母全细胞催化L-天门冬氨酸转化合成β-丙氨酸的反应；其中所述的重组酿酒酵母含有外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组酿酒酵母是含有外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因的酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeEBY100。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应中底物L-天门冬氨酸的浓度为0.1～1mol/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应温度30～60℃。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的反应温度50～60℃。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应体系pH值为6.0～8.0。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括反应后分离反应液与菌体的步骤，所得菌体用于新的反应体系。8.权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪皓，范超，刘军，吴文忠，
申请(专利权)人：大连医诺生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21