螺吡喃类衍生物及在检测G-四链体DNA和溶酶体中的应用制造技术

本发明专利技术公开了结构式（I）所示的化合物，其中，R’为氢或C1～C18的烷基，R’’为C1～C18的烷基。本发明专利技术是一种可比率型检测G4 DNA的荧光探针，该探针通过共聚焦显微镜和超高分辨显微镜，成功实现了在活细胞或固定后细胞中对G4 DNA和溶酶体的同时检测，尤其是实现了重要癌靶标分子G4 DNA在活细胞中的原位、实时、超清晰成像。

Spiro derivatives and their application in detecting G- four chain DNA and lysosomes

The invention discloses a compound shown in structural formula (I), wherein R is hydrogen or C1 to C18 alkyl, R 'is alkyl of C1 to C18. The present invention is a fluorescence probe with a ratio type detection of G4 DNA. Through confocal microscopy and ultrahigh resolution microscopy, the probe successfully realizes simultaneous detection of G4 DNA and lysosomes in living or immobilized cells, especially the in-situ, real-time and superclear of the important cancer target molecule G4 DNA in living cells. Clear imaging.

【技术实现步骤摘要】
螺吡喃类衍生物及在检测G-四链体DNA和溶酶体中的应用
本专利技术涉及螺吡喃类衍生物及在检测G-四链体DNA和溶酶体中的应用，属于化学生物学传感器

技术介绍
长期以来，科学家们展开了大量针对癌症治疗的研究，旨在杀死、杀伤肿瘤细胞，同时又不影响正常细胞。近年来，随着癌症生物学的发展，越来越精确的靶向治疗方法被发现，其中，G-四链体（G4）DNA和溶酶体成为最新的精准抗癌靶标。G4DNA是一种非传统的核酸结构，是由富含串联重复鸟嘌呤（G）的DNA折叠形成的高级结构，已被证实可稳定存在于人体活细胞中（BiffiG,TannahillD,McCaffertyJ,etal.NatureChemistry,2013,5,182）。它们不仅具有独特的结构，而且有着丰富的生物学功能。生物信息学表明，在人体基因组中大约含有~400000个可形成G4DNA的序列，并位于基因组许多重要的生物学功能区域。但是这些序列在肿瘤抑制基因中很少，反而在促进肿瘤发生或增殖的原癌基因中比例很高，如一些重要的原癌基因的启动子区，包括C-myc、C-kit、KRAS、bcl-2和VEGF等基因序列中。2016年，剑桥大学的研究团队通过对癌变前的人类细胞系进行研究，检测到了差不多一万个G4。该项研究指出G4主要位于调控基因开关的DNA区域，特别是与癌症有关的基因，因此，G4DNA现已成为癌症诊疗研究的新型靶标（Hänsel-HertschR,BeraldiD,LensingSV,etal.NatureGenetics,2016,48,1267）。溶酶体一直以来都被误认为是细胞的“垃圾桶”，但我们现在知道这一结构更像是细胞的“胃”。通过溶酶体，大分子可由水解酶进行降解，这些酶包括各种负责蛋白降解的蛋白酶，降解后细胞也能获得相应的营养成分。而且溶酶体参与了多种细胞生命过程，如物质代谢、细胞膜循环、细胞凋亡以及信号转导等。在肿瘤细胞中的溶酶体体积比在正常细胞中更大。一项近期的研究表明，溶酶体也可作为理想的药物靶标，用于选择性摧毁癌细胞（PetersenNHT,OlsenOD,Groth-PedersenL,etal.CancerCell,2013,24,379）。将细胞中溶酶体和G4DNA这两种靶标物可视化，不仅有助于理解溶酶体参与生命活动的分子机制,而且对癌症的早期精准筛查具有重要的指导意义。近年来，分别靶向溶酶体和G4DNA的分子光学探针已有报道，但目前为止，还受限于以下两点：1、未能实现比率型检测G4DNA；2、未能实现在细胞中同时检测溶酶体和G4DNA两种标靶物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型螺吡喃衍生物QIN及其制备方法。本专利技术的另一个目的是将上述螺吡喃衍生物QIN作为荧光探针应用于G4DNA的比率型检测，以及在细胞内对溶酶体和G4DNA的同时检测和成像。结构式（I）所示化合物，其中，R’为氢或C1～C18的烷基，R’’为C1～C18的烷基；R’优选为氢或C1～C6的烷基，R’’优选为C1～C6的烷基。上述化合物（I）的制备方法：化合物（A）与化合物（B）发生缩合反应得到化合物（I），反应式如下：上述反应温度为60～115°C，使用醇、乙腈、芳香烃作为溶剂，在有机胺类催化下，通过缩合反应得到化合物（I）。所述的醇选自甲醇、乙醇、异丙醇；芳香烃选自甲苯、苯；有机胺选自六氢吡啶、三乙胺、吡啶。本专利技术化合物（I）可应用在检测G-四链体DNA。本专利技术化合物（I）可应用在细胞内同时检测溶酶体和G-四链体DNA。本专利技术化合物（I）可应用在细胞荧光成像。本专利技术在没有光或酸碱刺激下，G4DNA也能够调控螺吡喃染料的开关和变色。G4DNA主要存在于细胞核内，而溶酶体作为细胞中的一种常见细胞器，位于细胞质区域，内含多种水解酶，其内环境的pH小于5.0，利用这种酸性环境的条件实现螺吡喃染料的变色。基于以上发现，本专利技术开发了可比率型检测G4DNA的荧光探针化合物（I），并借助共聚焦显微镜和超高分辨显微镜，成功实现了这类分子在细胞（活细胞或固定后细胞）中对G4DNA（核内）和溶酶体（核外）的同时比率型检测和成像。本专利技术的优点：（1）首次开发了可比率型检测G4DNA的荧光探针，因为比率型检测不受底物和探针浓度、外部环境和仪器条件变化等影响，可有效避免检测时的背景干扰和假阳性，从而实现对G4DNA和溶酶体的精准检测；（2）该探针通过共聚焦显微镜和超高分辨显微镜，成功实现了在细胞（活细胞或固定后细胞）中对G4DNA（核内）和溶酶体（核外）的同时检测，尤其是实现了重要癌靶标分子G4DNA在活细胞中的原位、实时、超清晰成像。附图说明图1为荧光探针QIN-1在缓冲溶液中对C-mycG4DNA不同浓度的荧光光谱；图2为荧光探针QIN-1在缓冲溶液中对C-mycG4DNA不同浓度的工作曲线图；图3为荧光探针QIN-1在缓冲溶液中对G4DNA、单链DNA、双链DNA的选择性柱状图；图4为荧光探针QIN-1在缓冲溶液中对C-mycG4DNA不同浓度的紫外光谱；图5为荧光探针QIN-1在缓冲溶液中与C-mycG4DNA圆二色谱；图6为荧光探针QIN-1在活的正常细胞和癌细胞中的荧光成像图；图7为荧光探针QIN-1在固定后HepG2细胞中DNA酶和RNA酶验证实验荧光成像图；图8为荧光探针QIN-1在固定后U-2OS细胞中DNA酶和RNA酶验证实验荧光成像图；图9为荧光探针QIN-1在U-2OS活细胞中的超分辨荧光成像图；图10为荧光探针QIN-1在固定后U-2OS细胞中DNA酶和RNA酶验证实验的超分辨荧光成像图。具体实施方式下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1荧光探针QIN-1的制备在干燥的25mL圆底烧瓶中，加入0.0717g(0.33mmol)8-羟基久洛尼定-9-甲醛，0.0993g(0.33mmol)1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘盐，30μL哌啶和10mL乙醇。回流9h。冷却，有粉红色固体析出，抽滤，乙醚洗涤滤饼，干燥得产物，即为荧光探针QIN-1，产量为0.0850g，产率为69%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.14(t,J=8.0Hz,1H),7.05(d,J=8Hz,1H),6.80(t,J=8.0Hz,1H),6.70(d,J=12.0Hz,1H),6.49(t,J=8.0Hz,2H),5.37(d,J=8.0Hz,1H),3.08(t,J=4.0Hz,2H),3.02(t,J=4.0Hz,2H),2.68(s,5H),2.39–2.35(m,2H),1.96–1.90(m,2H),1.83–1.77(m,2H),1.28(s,3H),1.15(s,3H);13CNMR(100MHz,CDCl3)δ150.07,148.60,144.05,137.46,129.47,127.19,124.22,121.32,118.56,113.42,112.88,107.85,107.17,106.60,104.18,51.03,50.14,49.67,28.93,27.04,25.85,22.33,21.41,20.41,20.34;HRMS(ESI)本文档来自技高网...

【技术保护点】
结构式（I）所示的化合物，

【技术特征摘要】
1.结构式（I）所示的化合物，其中，R’为氢或C1～C18的烷基，R’’为C1～C18的烷基。2.根据权利要求1所示的化合物，其特征在于：R’为氢或C1～C6的烷基，R’’为C1～C6的烷基。3.权利要求1所示化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：化合物（A）与化合物（B）发生缩合反应得到结构式（I）所示的化合物，反应式如下：。4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：反应温度为60～115°C...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭媛，李锦，王少静，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61