一种PD-1 CAR NK-92细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种PD‑1 CAR NK‑92细胞及其制备方法与应用，PD‑1 CAR NK‑92细胞是在NK‑92细胞内表达PD‑1‑CD8

A PD-1 CAR NK-92 cell and its preparation and Application

The invention discloses a cell PD, CAR, NK, and NK, and its preparation method and application. The cells of PD, 1, CAR, NK, and 92 are expressed in PD NK 1 92 CD8 cells in NK 92 cells.

【技术实现步骤摘要】
一种PD-1CARNK-92细胞及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种细胞及其制备方法与应用，特别涉及一种PD-1CARNK-92细胞及其制备方法与应用。
技术介绍
随着肿瘤免疫治疗研究的逐步进展，程序性死亡生长因子-1(PD-1/CD279)及其配体PD-L1/2(B7-H1/CD274)作为肿瘤微环境中的重要成员获得众多研究者的青睐。2014年9月4号，美国食品及药物管理局(foodanddrugadm-inistration，FDA)批准了Keytruda(pembrolizumab)用于治疗对其它药物治疗无效的晚期或无法切除的黑色素瘤患者，成为阻断PD-1细胞通路的首款获得FDA批准的药物。1992年PD-1首次被发现，其主要表达于T细胞、调节性T细胞、“耗尽”的T细胞、B细胞、活化单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞…。PD-1一般表达于活化的T细胞，其包括跨膜区、茎区、1个Ig超家族区和1个包含ITIM、ITSM的细胞内区。PD-1属于协同抑制受体，有2个配体，分别为PD-L1、PD-L2。PD-L1在不同的恶性肿瘤中异常表达，如肺、食管、头颈部的鳞状细胞癌以及其他类型的恶性肿瘤，如卵巢癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤和胶质瘤中表达，从结构上看，PD-L2与PD-L1类似，同属于I型跨膜蛋白，其包括信号肽、IgV样区、IgC样区、茎区、跨膜区和胞质区。PD-1与配体PD-L1/2结合使ITIM和ITSM内的酪氨酸磷酸化，ITIM、ITSM与SHP-1和SHP-2结合，通过BCL·XL的下调表达和T细胞的分化传递T细胞抑制性信号，间接导致细胞死亡。PD-1PD-L1/2途径也被认为是介导免疫抑制的路径，PD-1作为一个负性调控点起作用。PD-1和PD-L1途径的抑制作用在体外能加强T细胞应答；在体内PD-1与特异性配体(PD-L1、PD-L2)结合起作用，下调抗原刺激的淋巴细胞增殖及细胞因子的产生，最终导致淋巴细胞“耗尽”以及诱导免疫耐受。实体肿瘤中的肿瘤细胞可上调PD-L1的表达，继而提供下调激活T细胞的抑制信号，最终关闭免疫反应并诱导免疫耐受性。PD-Ll高表达的患者生存率显著下降，与大多数报道肿瘤细胞上PD-L1的高表达与不良预后相关且具有一致性。除在恶性黑色素瘤表达外，PD-L1还可在其他不同的肿瘤中表达，包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾细胞癌、头颈部及食管鳞状细胞癌和非小细胞肺癌，且肿瘤细胞上PD-Ll的高表达与不良预后相关。自然杀伤(NK)细胞是用于过继癌症免疫治疗的重要效应细胞类型。类似于T细胞，NK细胞可修饰以表达嵌合抗原受体(CARs)，以增强抗肿瘤活性。CD19CAR-T细胞在CD19阳性恶性肿瘤患者的成功应用，证明这种方法用于癌症免疫治疗(seee.g.Gruppetal,2013)的可行性。CAR-T细胞靶向多种不同的肿瘤抗原正在积极的进行临床开发(Kalosetal.,2013)。自然杀伤(NK)细胞的CARNK细胞免疫治疗尝试较少，到目前为止，对于这种做法没有临床数据可用。NK细胞在癌症免疫监视中起重要作用，并且代表用于过继癌症免疫疗法的重要效应细胞类型。与T细胞相比，它们不需要事先活化和识别复合体MHC分子呈递的肽抗原。相反，通过编码的细胞表面受体偶联CD3ζ分子，在适当的刺激下，NK细胞可表现出杀伤活性。因此，在NK细胞中，包含CD3ζ-CARs元件容易连结到内源性的信号通路中，并触发细胞裂解活性。尽管取得了这些进展，CARNK细胞临床开发经验仍然有限。I期研究表明未修饰的NK-92细胞，其被应用之前辐照，已经证明临床应用的安全性。然而并未表现出明显抗肿瘤活性，可能是由未修改的NK-92细胞缺乏肿瘤特异性受体而无法识别肿瘤。本专利技术人前期制备了PD-1CAR-T细胞来治疗肿瘤，但PD-1CAR-T细胞存在以下缺点：CAR-T细胞不同个体间存在移植物抗宿主反应(graftversushostreaction,GVHR)；需要个性定制且只能用于单一病人，造成时间长；病人T细胞状态不佳容易制备失败；不同病人来源的T细胞制备的CAR-T活性不一致导致药物效果不稳定等，上述问题亟待解决。
技术实现思路
本专利技术提供一种PD-1CARNK-92细胞及其制备方法与应用，解决不同病人来源的T细胞制备的CAR-T活性不一致导致药物效果不稳定的问题。为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供一种PD-1CARNK-92细胞，所述PD-1CARNK-92细胞是在NK-92细胞内表达PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述PD-1蛋白的胞外段具有：a)如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，或b)将a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述CD8TM具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；或者，是将SEQIDNO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述4-1BB的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；或者，是将SEQIDNO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中的所述4-1BB能替换为CD28，所述CD28的分子序列如SEQIDNO：3所示；或者，是将SEQIDNO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示；或者，是将SEQIDNO：4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示；或者，是将SEQIDNO：6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。本专利技术还提供一种编码融合蛋白PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ的基因，所述的融合蛋白PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ的基因序列如SEQIDNO：7所示；或者，在严格条件下与SEQIDNO：7所示的序列杂交且编码具有预防和/或治疗肿瘤症功能的相关蛋白的DNA分子；或者，与SEQIDNO：7所示的序列具有至少90％以上或95％以上或98％以上同源性且编码具有预防和/或治疗肿瘤症功能的相关蛋白的DNA分子。所述融合蛋白PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ中PD-1的基因序列如SEQIDNO：8所示；或者，在严格条件下与SEQIDNO：8所示的序列杂交且编码具有相应功能的相关蛋白的DNA分子；或者，与SEQIDNO：8所示的序列具有至少90％以上或95％以上或98％以上同源性且编码具有相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PD‑1 CAR NK‑92细胞，其特征在于，所述PD‑1 CAR NK‑92细胞是在NK‑92细胞内表达PD‑1‑CD8

【技术特征摘要】
1.一种PD-1CARNK-92细胞，其特征在于，所述PD-1CARNK-92细胞是在NK-92细胞内表达PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，所述NK-92细胞来源于CRL2407TM。2.根据权利要求1所述的PD-1CARNK-92细胞，其特征在于：所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述PD-1蛋白的胞外段具有：a)如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，或b)将a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的PD-1CARNK-92细胞，其特征在于：所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述CD8TM具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；或者，是将SEQIDNO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的PD-1CARNK-92细胞，其特征在于：所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述4-1BB的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；或者，是将SEQIDNO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的PD-1CARNK-92细胞，其特征在于：所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中的所述4-1BB能替换为CD28，所述CD28的分子序列如SEQIDNO：3所示；或者，是将SEQIDNO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。6.根据权利要求1所述的PD-1CARNK-92细胞，其特征在于：所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示；或者，是将SEQIDNO：4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。7.根据权利要求1所述的PD-1CARNK-92细胞，其特征在于：所述PD-1-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示；或者，是将SEQIDNO：6所示的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华顺，王保垒，韩昆昆，任宝永，
申请(专利权)人：阿思科力苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32