一种菌渣中红霉素残留的检测方法技术

一种菌渣中红霉素残留的检测方法，它涉及一种菌渣中红霉素残留效价的检测方法，该方法包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备，之后采用高效液相色谱法以梯度洗脱的方式将上述标准品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算红霉素效价。本发明专利技术通过对色谱条件的优选及供试品、标准品制备方法的试验，建立了菌渣中红霉素的液相色谱分析方法；通过对色谱分离系统的优化，建立了菌渣中红霉素的检测方法，通过方法学验证试验研究表明：所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，能有效检测菌渣中红霉素效价。

【技术实现步骤摘要】
一种菌渣中红霉素残留的检测方法
本专利技术涉及菌渣的检测检验
，特别是涉及一种菌渣中红霉素残留效价的检测方法。
技术介绍
红霉素(Erythromycin)是McGuire等人在1952年发现的，是由红霉素链霉菌(Streptomyceserythraeus)产生的十四元大环内酯类抗生素的主要品种。红霉素分为红霉素A、B、C和D，其中红霉素A具有抗菌活性，是红霉素主要的活性成分。虽然红霉素B的抗菌谱和抗菌活性与红霉素A相似，但是红霉素B的毒性比较大。红霉素C不是活性物质，而且是我国生产的红霉素的主要杂质。多年来世界各国的药学工作者根据红霉素酸缩酮化失效原理，对红霉素的化学结构和抗菌活性进行了一系列的广泛而又深入的研究，获得了一大批具有药代动力学新特性的红霉素类大环内酯品种：罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、氟红霉素等衍生物。这些衍生物的出现使大环内酯类抗生素在抗感染药物中所拥有的市场份额进一步扩大。红霉素菌渣是以淀粉、黄豆粉、玉米浆为主要原料，加入红霉素菌种-红色糖多霉菌经过好氧深层发酵生产红霉素后产生的废渣，除了含有大量的水分外，其主要成分为残留淀粉及其他糖类、残留黄豆粉，大量菌丝体、部分无机物以及少量的红霉素残留(在菌渣原液中的浓度约600-1400U/mL)。红霉素菌渣散发出一种特殊异味，而且，菌渣有机物含量高，如果不加以处置任意废弃可引起二次发酵，颜色变黑，产生恶臭味，引来大量苍蝇，环境十分恶劣。依据2008年修订后的《国家危险废物名录》，抗生素菌渣属于化学药品原料药生产过程中的培养基废物，须按危险废物进行管理。抗生素菌渣含有残留抗生素及代谢中间产物等，是一种特殊的危险废物，如处置不当，会对生态环境以及人体健康产生潜在的危害，其危害具有隐蔽性、滞后性、累计性、协同性和连带性等特点。
技术实现思路
针对目前国内外尚无菌渣红霉素残留标准检测方法这一现状，没有一种有效解决基质效应的影响，且现有技术无法快速/准确检测菌渣中红霉素残留量的问题，本专利技术建立一种菌渣中红霉素残留的检测方法。本专利技术的一种菌渣中红霉素残留的检测方法，它是按照以下步骤进行的：一、供试品样品制备：1)称取含有红霉素的菌渣，加入提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液，涡旋振荡45～60s，然后在超声中辅助提取20～30min，再以3500～4000rpm离心5～10min，取上清液，收集沉淀；2)向步骤1)收集的沉淀中加入提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液，涡旋振荡45～60s，然后在超声中辅助提取20～30min，再以3500～4000rpm离心5～10min，取上清液；3)合并步骤1)和步骤2)的上清液，置于35℃水浴旋转蒸发至上清液体积的五分之一，得无机相；4)向无机相中加入pH为4～7的Tris-CaCl2复溶液，震荡涡旋，待残渣全部溶解后，调节至pH＝8～10，再加入分散剂甲醇，萃取剂1,2-二氯乙烷，涡旋30s，4000r/min离心5min，抽取下层液体；5)向步骤4)下层液体中加入萃取剂1,2-二氯乙烷涡旋30～45s，4000r/min离心5min，抽取下层液体；6)重复步骤1)至5)的操作，抽取下层液体；7)合并步骤5)和步骤6)的下层液体，用氮气吹至近干后用甲醇复溶，将复溶液过0.45μm滤膜后，即得供试品样品；其中，红霉素菌渣与提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液的质量体积比为1g：12～17mL；沉淀与提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液的质量体积比为1g：12～17mL；无机相与Tris-CaCl2复溶液的体积比为4～8:10；无机相与分散剂甲醇的体积比为4～8:1；无机相与萃取剂1,2-二氯乙烷的的体积比为4～8:1；二、标准曲线绘制：用甲醇将红霉素标准贮备液稀释成质量浓度为1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L、500.00mg/L和1000.00mg/L的标准工作溶液，采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，并求回归方程和相关系数；三、测定：吸取上述浓度为500.00mg/L的标准工作品溶液和供试品样品，分别注入液相色谱仪中，根据外标法计算红霉素残留效价；即完成所述的菌渣中红霉素残留的检测方法；色谱条件：色谱柱：色谱柱为Waters-C18柱，色谱柱内径为4.6mm，柱长250mm，填料颗粒直径为5μm，流动相：乙腈-0.01moL/L磷酸氢二钾溶液体系等度洗脱，检测波长：215nm，流速：1mL/min，柱温：20～35℃。本专利技术包含以下有益效果：本专利技术通过对色谱优选及供试品、标准品制备方法的试验，建立了红霉素菌渣中红霉素的高效液相-紫外检测器检测分析方法；通过对色谱条件的优化，建立了菌渣中红霉素的检测方法，通过方法学验证试验研究表明：所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，能有效检测菌渣中红霉素残留量。通过验证，本专利技术的方案在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。添加水平为200mg/kg，方法回收率为96.32％。此方法定性检出限为0.0660mg/Kg，定量检出限为0.2210mg/Kg。RSD为8.85％。通过本专利技术的方法可以有效地从菌渣中提取红霉素，尽最大可能降低菌渣中其他杂质对后续检测的影响，从而提高检测的准确度。附图说明图1为实施例1的红霉素标样高效液相色谱图；图2为实施例1的菌渣中红霉素含量高效液相色谱图；图3为实施例2的红霉素标样高效液相色谱图；图4为实施例2的菌渣中红霉素含量高效液相色谱图。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的一种菌渣中红霉素残留的检测方法，它是按照以下步骤进行的：一、供试品样品制备：1)称取含有红霉素的菌渣，加入提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液，涡旋振荡45～60s，然后在超声中辅助提取20～30min，再以3500～4000rpm离心5～10min，取上清液，收集沉淀；2)向步骤1)收集的沉淀中加入提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液，涡旋振荡45～60s，然后在超声中辅助提取20～30min，再以3500～4000rpm离心5～10min，取上清液；3)合并步骤1)和步骤2)的上清液，置于35℃水浴旋转蒸发至上清液体积的五分之一，得无机相；4)向无机相中加入pH为4～7的Tris-CaCl2复溶液，震荡涡旋，待残渣全部溶解后，调节至pH＝8～10，再加入分散剂甲醇，萃取剂1,2-二氯乙烷，涡旋30s，4000r/min离心5min，抽取下层液体；5)向步骤4)下层液体中加入萃取剂1,2-二氯乙烷涡旋30～45s，4000r/min离心5min，抽取下层液体；6)重复步骤1)至5)的操作，抽取下层液体；7)合并步骤5)和步骤6)的下层液体，用氮气吹至近干后用甲醇复溶，将复溶液过0.45μm滤膜后，即得供试品样品；其中，红霉素菌渣与提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液的质量体积比为1g：12～17mL；沉淀与提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液的质量体积比为1g：12～17mL；无机相与Tris-CaCl2复溶液的体积比为4～8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菌渣中红霉素残留的检测方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、供试品样品制备：1)称取含有红霉素的菌渣，加入提取剂乙腈‑Tris‑CaCl2溶液，涡旋振荡45～60s，然后在超声中辅助提取20～30min，再以3500～4000rpm离心5～10min，取上清液，收集沉淀；2)向步骤1)收集的沉淀中加入提取剂乙腈‑Tris‑CaCl2溶液，涡旋振荡45～60s，然后在超声中辅助提取20～30min，再以3500～4000rpm离心5～10min，取上清液；3)合并步骤1)和步骤2)的上清液，置于35℃水浴旋转蒸发至上清液体积的五分之一，得无机相；4)向无机相中加入pH为4～7的Tris‑CaCl2复溶液，震荡涡旋，待残渣全部溶解后，调节至pH＝8～10，再加入分散剂甲醇，萃取剂1,2‑二氯乙烷，涡旋30s，4000r/min离心5min，抽取下层液体；5)向步骤4)下层液体中加入萃取剂1,2‑二氯乙烷涡旋30～45s，4000r/min离心5min，抽取下层液体；6)重复步骤1)至5)的操作，抽取下层液体；7)合并步骤5)和步骤6)的下层液体，用氮气吹至近干后用甲醇复溶，将复溶液过0.45μm滤膜后，即得供试品样品；其中，红霉素菌渣与提取剂乙腈‑Tris‑CaCl2溶液的质量体积比为1g：12～17mL；沉淀与提取剂乙腈‑Tris‑CaCl2溶液的质量体积比为1g：12～17mL；无机相与Tris‑CaCl2复溶液的体积比为4～8:10；无机相与分散剂甲醇的体积比为4～8:1；无机相与萃取剂1,2‑二氯乙烷的的体积比为4～8:1；二、标准曲线绘制：用甲醇将红霉素标准贮备液稀释成质量浓度为1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L、500.00mg/L和1000.00mg/L的标准工作溶液，采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，并求回归方程和相关系数；三、测定：吸取上述浓度为500.00mg/L的标准工作品溶液和供试品样品，分别注入液相色谱仪中，根据外标法计算红霉素残留效价；即完成所述的菌渣中红霉素残留的检测方法；色谱条件：色谱柱：色谱柱为Waters‑C18柱，色谱柱内径为4.6mm，柱长250mm，填料颗粒直径为5μm，流动相：乙腈‑0.01moL/L磷酸氢二钾溶液体系等度洗脱，检测波长：215nm，流速：1mL/min，柱温：20～35℃。...

【技术特征摘要】
1.一种菌渣中红霉素残留的检测方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、供试品样品制备：1)称取含有红霉素的菌渣，加入提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液，涡旋振荡45～60s，然后在超声中辅助提取20～30min，再以3500～4000rpm离心5～10min，取上清液，收集沉淀；2)向步骤1)收集的沉淀中加入提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液，涡旋振荡45～60s，然后在超声中辅助提取20～30min，再以3500～4000rpm离心5～10min，取上清液；3)合并步骤1)和步骤2)的上清液，置于35℃水浴旋转蒸发至上清液体积的五分之一，得无机相；4)向无机相中加入pH为4～7的Tris-CaCl2复溶液，震荡涡旋，待残渣全部溶解后，调节至pH＝8～10，再加入分散剂甲醇，萃取剂1,2-二氯乙烷，涡旋30s，4000r/min离心5min，抽取下层液体；5)向步骤4)下层液体中加入萃取剂1,2-二氯乙烷涡旋30～45s，4000r/min离心5min，抽取下层液体；6)重复步骤1)至5)的操作，抽取下层液体；7)合并步骤5)和步骤6)的下层液体，用氮气吹至近干后用甲醇复溶，将复溶液过0.45μm滤膜后，即得供试品样品；其中，红霉素菌渣与提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液的质量体积比为1g：12～17mL；沉淀与提取剂乙腈-Tris-CaCl2溶液的质量体积比为1g：12～17mL；无机相与Tris-CaCl2复溶液的体积比为4～8:10；无机相与分散剂甲醇的体积比为4～8:1；无机相与萃取剂1,2-二氯乙烷的的体积比为4～8:1；二、标准曲线绘制：用甲醇将红霉素标准贮备液稀释成质量浓度为1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L、500.00mg/L和1000.00mg/L的标准工作溶液，采...

【专利技术属性】
技术研发人员：王义，张鹏，金昌福，李宁飞，
申请(专利权)人：宁夏希望田野生物农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏,64