本发明专利技术公开了一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法，特点是具体步骤如下：（1）基于载体辅助液液萃取技术通过一次性前处理，完成涵盖了理化性质差异很大的常见8大类，共计99种兽药残留的提取、净化工作；（2）混合标准溶液组成和基质标准曲线制备；（3）利用超高效液相色谱‑三重四极杆串联质谱联用测定待测样品中99种兽药残留的浓度；优点是该方法的前处理和仪器分析过程针对不同理化性质的化合物兼容性强，检测效率高，可操作性强，检测限能满足所有受试的目标物并且降低了检测成本。
High throughput detection method for 99 Kinds of veterinary drug residues in animal source food
The invention discloses a 99 Kinds of veterinary drug residues in animal derived food high-throughput detection method is as follows: (1) based on carrier assisted liquid-liquid extraction technology by one-time pretreatment, covering the complete difference of physicochemical properties very common in 8 categories, a total of 99 Kinds of extraction and purification of veterinary drug residues work; (2) the matrix composition and the standard curve of mixed standard solution preparation; (3) using ultra performance liquid chromatography tandem three determination of 99 Kinds of veterinary drug residues concentration in the sample with tandem mass spectrometry; analysis of pretreatment and instrument has the advantages of the method according to the different physicochemical properties of compound compatibility the strong, high detection efficiency, strong operability, the detection limit can meet the target of all subjects and reduce the test cost.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种兽药残留检测方法，尤其是涉及一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法。
技术介绍
兽药的种类很多，残留毒理学意义较大的兽药按其用途可以分类主要包括：抗生素类、合成抗菌素类、抗寄生虫类、生长促进剂和杀虫剂等。根据联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）兽药残留联合立法委员会的定义，兽药残留（veterinarydrugresidues）是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及其代谢物，以及与兽药有关的杂质。[1]由于兽药残留的对人体的危害极大，因此动物源性食品中的兽药残留是世界各国食品安全检测的重要指标，我国政府也制定了一系列法律法规和技术标准限制兽药残留的超标。然而，综观近年来中国畜牧业的发展，由于养殖条件的差异和利益驱使等因素的影响，兽药残留超标现象时有发生。据报道，我国每年食品中毒人数高达2万～4万人，而专家估计这个数字尚不到实际发生数的1/10。2009年，广州市民食用含“瘦肉精”猪肝70多人食物中毒。刘军等对135份鲜牛乳中的四环素类抗生素残留进行了检测，金霉素、土霉素、四环素残留的检出率分别为8％、18％、14％；张莉等对哈尔滨市市售鸡肉、鸡肝中的土霉素残留进行了检测，阳性率分别为64％，80％。另外，动物源性食品中激素类药物残留的情况也非常普遍，郭子侠等对北京市售的动物鞭、胎盘、蛇、甲鱼等动物原料生产的保健食品进行了检测，检出率分别为32.6％，47.8％，32.6％和15.2％；还对牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸡蛋、鱼、牛奶等七类动物性食品中的雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮、睾酮类5种性激素进行了调查，结果显示7类上述食品的激素检出率均超过20%。2012年，肯德基供应商-六和集团被曝光对原料鸡养殖过程中所用抗生素种类达18种，其中很多抗生素停药期不停用；此外还有一些养鸡场在使用国家禁用的地塞米松激素类药物。这些事件的屡有发生对兽药残留检测技术提出了更高的要求。目前，我国可以用于兽药残留检测的国家标准多达数十个，但大多是按照兽药类别建立的仅仅适用于某一种动物源性食品中某一类兽药残留的分析方法。这些方法的样品前处理过程各异，耗时较长，检测项目覆盖范围小，无法满足多残留筛查的需求。因此，研究建立动物源性食品中多种类兽药残留高通量筛查技术对于有效提高监管工作效率，保障我国人民的食品安全具有非常重要的意义。兽药残留分析方法包括了样品前处理技术和仪器分析技术。由于兽药残留水平很低，样品基质复杂、干扰物质多，不易进行分离、纯化，因此样品前处理是整个兽药残留分析检测过程中耗时最长、劳动强度最大、同时也是产生误差最多的一个环节。常见的兽药残留样品前处理技术有固相萃取、固相微萃取、基质分散固相萃取、免疫亲和色谱技术、分子印迹技术、超临界流体萃取、加速溶剂萃取等，这些前处理方法在兽药残留分析中的应用各有其特点,但都存在有选择性限制的缺点，样品处理通量也不够高。为了能够同时分析检测不同物理和化学性质的多种兽药残留，需要发展非选择性的高通量样品制备方法。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）法因其具有快速、简单、便宜、有效、耐用和安全可靠等特点而得名，在农药多残留检测中得到了广泛的应用。随着应用推广的不断展开，QuEChERS法在兽药残留检测方面的应用也日趋增多。牛乳、鸡蛋、肝脏、肌肉组织中的磺胺类、喹诺酮类、苯并咪唑类、阿维菌素类等兽药残留的QuEChERS检测方法均有报道。尽管目前QuEChERS法在兽药残留高通量分析检测方面已经有了较多的应用，但已有的研究表明应用QuEChERS方法在测定例如青霉素类、四环素类、喹诺酮类等极性较强的兽药时，存在着回收率低，无法满足残留分析要求的不足。载体辅助液液萃取（SupportedLiquid-LiquidExtraction，SLLE）是一项重要的样品前处理技术，它以硅藻土等为固体载体，保留吸附含水提取溶液中的待测化合物，再以与其不相容的有机溶剂洗脱达到样品提取、净化、浓缩的目的，在农药残留、药物分析等领域有着广泛的应用。与传统液液萃取相比，SLLE无需借助分液漏斗及大量有机溶剂多次提取待测组分，操作步骤简单、溶剂用量小、不易发生乳化、重现性好等优点。仪器分析技术随着质谱的发展和推广，一次分析检测完成多个或多类残留已成为可能。近年来，动物源食品中兽药残留正逐渐由用液相色谱-三重四级杆质谱（LC-MS/MS）进行目标型检测向用高分辨质谱（HRMS）进行精确质量非目标型全扫描检测转变。传统的LC-MS/MS在定量分析上有一定的优势，但也存在不足，如：只有质谱方法中涵盖的化合物才可被检测到，分析化合物数量有限，需要对每种化合物进行参数优化，比较耗时，对基质的干扰比较敏感，相关的样品制备方法较为复杂；分辨率低，不能有效区分分子量相近的化合物，会造成假阳性结果等。与LC-MS/MS相比，HRMS主要依靠精确质量数（可精确到小数点第4位）和保留时间来对待测物进行定性识别。静电场轨道阱高分辨质谱（OrbitrapMS）是近年来新兴的一种傅里叶转换高分辨质谱，其参数设定简单，基于真实高分辨能力的高准确度，真实的同位素峰型分布测定能力，其精确质量数可以给出元素组成，从而提供待测物结构信息，能够更彻底地排除基质干扰，将质量数非常相近的样品背景基质干扰物质和待测物区分开，大大降低了分析检测中对色谱分离的要求。OrbitrapMS可通过全扫描进行非定向和未知化合物的筛选，需要增加目标化合物时，不必再次处理样品和进样，重新分析已有的全扫描数据即可；还可进行多级扫描，通过再打碎得到MS/MS谱图进行谱库检索或者与标准物质比对来确证待测物。刘鑫等利用QuadrupoleOrbitrapMS同时检测了鸡肉中喹诺酮类、磺胺类、β-受体激动剂类等81种兽药残留，试样经乙腈超声提取，浓缩后用体积分数50%乙腈溶液定容后上机测定。试验结果表明：各组分线性关系良好，线性回归系数均在0.98以上。取10ng/mL基质加标液，重复进样5次，各组分重复性良好，RSD均在15%以内。实际样品中待测组分的结果确认借助通过标准物质建立的二级质谱库检索比对来完成。Hurtaud-Pessel等通过两步萃取，利用LTQ-Orbitrap-MS全扫描方式筛查了肉类样品中青霉素、先锋霉素、磺胺类等多种兽药的残留情况。尽管已有一些学者开始研究动物源性食品中多种兽药残留的分析方法，但这些方法样品前处理过程往往仅适用于某一些动物源性食品，检测的项目也仅仅局限于某一类或几类兽药的残留，还不能完全满足动物源性食品中多种类兽药残留的监控要求。因此，亟需建立一种能完全满足动物源性食品中多种类兽药残留检测的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法，该方法的前处理和仪器分析过程针对不同理化性质的化合物兼容性强，检测效率高，可操作性强，检测限能满足所有受试的目标物并且降低了检测成本。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：1、一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法，具体步骤如下：（1）样品前处理称取液体样品5.00g或者浓度为1g/mL的固体水溶液5mL于50mL离心管本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法，其特征在于具体步骤如下：（1）样品前处理称取液体样品5.00 g或者浓度为1 g /mL的固体水溶液5mL于50 mL离心管中，加入5 mL 提取液，10 mL乙腈，斡旋充分混匀，以4500 r/min离心5 min，上清液转移至另一50 mL离心管中，再在上清液中加入1g硫酸铵，充分混匀后离心5 min，得到上层乙腈相和下层水相，取下层水相过硅藻土柱，下接50ml离心管，并加入0.5ml二甲基亚砜得到上样液；将上样液上硅藻土柱后平衡15分钟，然后将上层乙腈相过硅藻土柱进行洗脱，再依次用10ml，10ml，6ml乙腈清洗离心管中残余的上样液后，清洗液上硅藻土柱后，洗脱液用纯乙腈定容至25ml；将定溶液均分为2份，分别置于15ml具刻度离心管中，在微弱的氮气流下吹干至1ml，用纯水定容至2ml，取出1ml置于1.5ml离心管中，于‑4℃，15000 r/min下离心10 min，然后取400μL 上清液置于带衬管的进样瓶中进样分析；同时做试剂空白样品；（2）混合标准溶液组成和基质标准曲线制备A．混合标准溶液组成：磺胺类包括磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺二甲异嘧啶，磺胺醋酰，磺胺吡啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺多辛，磺胺间甲氧嘧啶，磺胺对甲氧嘧啶，磺胺喹恶啉，磺胺二甲恶唑，磺胺二甲异恶唑，磺胺甲恶唑，磺胺噻唑，磺胺氯哒嗪，磺胺甲噻二唑，磺胺苯甲酰，磺胺苯吡唑，三甲氧苄胺嘧啶和磺胺胍，各成分浓度均为1.0ug/mL；喹诺酮类包括乙胺嘧啶, 环丙沙星, 恩诺沙星, 氧氟沙星, 诺氟沙星, 沙拉沙星, 培氟沙星, 奈啶酸, 奥索利酸, 氟甲奎, 吡哌酸, 西诺沙星, 麻保沙星, 司帕沙星, 双氟沙星, 单诺沙星, 奥比沙星, 洛美沙星和依诺沙星，各成分浓度均为1.0ug/mL；激素类包括可的松，泼尼松，甲基泼尼松龙，炔诺酮，炔雌醇，醋酸美仑孕酮，己烷雌酚，己二烯雌酚，醋酸甲羟孕酮，雌酮，氢化可的松，孕酮，雌三醇，地塞米松，醋酸甲地孕酮，睾酮，泼尼松龙，雌二醇，己烯雌酚，甲睾酮，表睾酮，丙酸睾酮，苯甲酸雌二醇，追宝龙，诺龙，甲孕酮，17α‑羟基孕酮和勃地酮(去氢睾酮)），各成分浓度均为0.1 ug/mL；红霉素类包括红霉素，替米考星，竹桃霉素，泰乐霉素，克林霉素，螺旋霉素，吉他霉素，交沙霉素，林可霉素和泰妙菌素，各成分浓度均为0.1 ug/mL；孔雀石绿类包括孔雀石绿，隐色孔雀石绿，结晶紫和隐色结晶紫，各成分浓度均为0.1ug/mL；青霉素类包括氨苄青霉素，乙氧萘青霉素，邻氯青霉素，头孢氨苄，双氯青霉素，青霉素G和阿莫西林，各成分浓度均为1.0ug/mL；四环素类包括土霉素，强力霉素，金霉素和四环素，各成分浓度均为1.0ug/mL；氨苯砜类包括金刚乙胺，苯乙醇胺 A，N‑乙酰氨苯砜，氨苯砜，金刚烷胺，吡喹酮和氯丙嗪，各成分浓度均为0.1ug/mL；B．基质标准曲线定量：在空白样品中分别加入上述8种混合标准溶液0 μL，10 μL，20 μL，40 μL，100 μL，以浓度为横坐标，仪器响应值（响应值=标准品峰面积/标准品质量）为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据；（3）超高效液相色谱‑三重四极杆串联质谱联用测定A．高效液相分离色谱柱：Hypersile Gold C18色谱柱，若测定激素成分则采用的型号为100mm x 2.1mm, 1.9μm，若测定混合标准溶液中的其余成分则采用的型号为100mm x 2.1mm, 3μm；若测定激素成分，则流动相A：含有0.1wt%氨水的甲醇溶液；流动相B：含有0.1wt%氨水的水‑甲醇溶液，其中水与甲醇的体积比为95:5；若测定混合标准溶液中的其余成分则：流动相A：含有0.1wt%甲酸以及5mM乙酸铵的乙腈‑水溶液，其中乙腈与水的体积比为95:5；流动相B：含有0.1wt%甲酸以及5mM乙酸铵的水‑乙腈溶液，其中水与乙腈的体积比为95:5；流速：0.3 mL/min；进样量：10 mL；若测定激素成分HPLC洗脱程序如下：；若测定混合标准溶液中的其余成分则HPLC洗脱程序如下：；B．质谱检测离子源：HESI‑II；喷雾电压：若测定激素成分则采用正离子模式3800V/负离子模式2700V；若测定混合标准溶液中的其余成分则采用正离子模式3800V ；气化温度：350℃；鞘气压：N2，35 arb；辅助气压：N2，10 arb；，离子传输管管温度：300℃；质量范围：m/z 100‑1000 (R 70000)；（4）浓度计算方法样品中待测物的含量根据如下计算公式（1）得到：X=2*C*V/m，式中：X－ 试样中待测物含量，单位为μg/kg；C－ 试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/LV— 定容体...
【技术特征摘要】
1.一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法，其特征在于具体步骤如下：（1）样品前处理称取液体样品5.00g或者浓度为1g/mL的固体水溶液5mL于50mL离心管中，加入5mL提取液，10mL乙腈，斡旋充分混匀，以4500r/min离心5min，上清液转移至另一50mL离心管中，再在上清液中加入1g硫酸铵，充分混匀后离心5min，得到上层乙腈相和下层水相，取下层水相过硅藻土柱，下接50ml离心管，并加入0.5ml二甲基亚砜得到上样液；将上样液上硅藻土柱后平衡15分钟，然后将上层乙腈相过硅藻土柱进行洗脱，再依次用10ml，10ml，6ml乙腈清洗离心管中残余的上样液后，清洗液上硅藻土柱后，洗脱液用纯乙腈定容至25ml；将定溶液均分为2份，分别置于15ml具刻度离心管中，在微弱的氮气流下吹干至1ml，用纯水定容至2ml，取出1ml置于1.5ml离心管中，于-4℃，15000r/min下离心10min，然后取400μL上清液置于带衬管的进样瓶中进样分析；同时做试剂空白样品；（2）混合标准溶液组成和基质标准曲线制备A．混合标准溶液组成：磺胺类包括磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺二甲异嘧啶，磺胺醋酰，磺胺吡啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺多辛，磺胺间甲氧嘧啶，磺胺对甲氧嘧啶，磺胺喹恶啉，磺胺二甲恶唑，磺胺二甲异恶唑，磺胺甲恶唑，磺胺噻唑，磺胺氯哒嗪，磺胺甲噻二唑，磺胺苯甲酰，磺胺苯吡唑，三甲氧苄胺嘧啶和磺胺胍，各成分浓度均为1.0ug/mL；喹诺酮类包括乙胺嘧啶,环丙沙星,恩诺沙星,氧氟沙星,诺氟沙星,沙拉沙星,培氟沙星,奈啶酸,奥索利酸,氟甲奎,吡哌酸,西诺沙星,麻保沙星,司帕沙星,双氟沙星,单诺沙星,奥比沙星,洛美沙星和依诺沙星，各成分浓度均为1.0ug/mL；激素类包括可的松，泼尼松，甲基泼尼松龙，炔诺酮，炔雌醇，醋酸美仑孕酮，己烷雌酚，己二烯雌酚，醋酸甲羟孕酮，雌酮，氢化可的松，孕酮，雌三醇，地塞米松，醋酸甲地孕酮，睾酮，泼尼松龙，雌二醇，己烯雌酚，甲睾酮，表睾酮，丙酸睾酮，苯甲酸雌二醇，追宝龙，诺龙，甲孕酮，17α-羟基孕酮和勃地酮(去氢睾酮)），各成分浓度均为0.1ug/mL；红霉素类包括红霉素，替米考星，竹桃霉素，泰乐霉素，克林霉素，螺旋霉素，吉他霉素，交沙霉素，林可霉素和泰妙菌素，各成分浓度均为0.1ug/mL；孔雀石绿类包...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈树兵，陈先锋，李双，朱海强，方科益，劳华均，
申请(专利权)人：宁波出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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