一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法，该方法包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备，之后采用高效液相色谱法检测，将上述标准品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算林可霉素效价。本发明专利技术通过对色谱条件的优选及供试品、标准品制备方法的试验，建立了菌渣中林可霉素的高效液相色谱检测分析方法；通过对色谱条件和净化工艺的优化，建立了菌渣中林可霉素的检测方法，通过方法学验证试验研究表明：所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，能有效检测菌渣中残留林可霉素。

【技术实现步骤摘要】
一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法
本专利技术涉及抗生素的检测
，特别是涉及一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法。
技术介绍
目前抗生素类药物应用广泛，主要应用方式是作为兽药，其检测主要集中在动物源性食品中。主要的检测方法有高效液相色谱法，高效液相色谱-串联质谱法，毛细管电泳法，酶联免疫法。抗生素菌渣是发酵生产抗生素过程中的副产物，主要由发酵菌丝体、糖类、粗蛋白、少量未利用完全的无机盐以及未提取完全的抗生素和其代谢产物组成。外观呈豆腐渣样，气味因培养的菌类不同而异，含水率一般较高，堆积存放容易二次发酵产生臭味气体。在利用微生物发酵生产林可霉素的过程中由于提取率低菌渣中残留大量的林可霉素，而且极难降解，造成严重的环境污染。据有关资料统计，我国林可霉素年排放量约为数百万吨，目前主要处理方式是占用土地堆放。林可霉素菌渣外观呈土青色，含水率在70-85％之间，堆放处理不仅造成资源浪费，而且经雨水冲刷后还会污染土壤、地下水等生态环境。过去一直对菌渣采用干燥加工处理后作为饲料或饲料添加剂使用。但是，近期研究结果发现，菌渣中残留的抗生素会在动物体内积累，人类食用此类动物源性食品会对身体造成危害。而且动物长期使用抗生素，会对其产生抗药性，诱导产生耐药细菌，破坏环境的微生态平衡。2008年中国将抗生素菌渣列入危险废物的名单，抗生素菌渣未经无害化处理严禁二次利用。建立稳定、灵敏、高效的菌渣林可霉素残留量检测方法，为菌渣污染控制标准的制定奠定基础。抗生素在菌丝体残留量的检测在国外研究比较早，主要是检测青霉素发酵中间产物中青霉素含量。目前国内报道的检测菌渣中林可霉素的方法是微生物培养法，此方法的灵敏度均较低，而且方法不完善，方法的准确度和精密度以及检出限均有待考量，不能满足现代残留检测分析的要求。因此，准确可靠的残留检测方法还有待探讨。
技术实现思路
本专利技术的目的是弥补现有技术中无法快速/准确检测林可霉素菌渣中林可霉素的缺陷，没有一种有效解决基质效应的影响的问题，而提供一种林可霉素菌渣中林可霉素提取且测定残留量的方法，以期为探明林可霉素菌渣中林可霉素的残留及其转化提供方法依据。本专利技术的一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法，它是按照以下步骤进行的：一、供试品样品制备：1)称取含有林可霉素的菌渣，加入体积百分含量为0.1％～0.15％的氨化乙腈提取剂，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液；2)称取PSA、C18和无水Na2SO4，涡旋混合1min后加入上一步的上清液，继续涡旋1min，以4000rpm/min离心10min，收集上清液，得供试品溶液；二、标准曲线绘制：用甲醇将林可霉素标准贮备液稀释成质量浓度为10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L、50mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和400mg/L标准工作溶液；采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；三、测定：吸取上述标准品工作溶液和供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算林可霉素素残留量；色谱条件：色谱柱：AglientExtend-C18柱，色谱柱内径为4.6mm，柱长250mm，填料颗粒直径为5μm，流动相：甲醇-0.05moL/L四硼酸钠十水合物按体积比为60:40混合的溶液，检测波长：214nm，进样量：10μL，流速：1mL/min，柱温：30℃。本专利技术包含以下有益效果:应用本方法进行林可霉素菌渣中林可霉素残留的测定，操作简便，准确度高，林可霉素含量与峰面积具有良好的线性关系，回收率、灵敏度、检出限以及相对标准偏差等均能满足残留分析的要求。经实验证明，该方法能用于各种性质差异较大的林可霉素菌渣，其回收率、灵敏度、检出限等在各批次菌渣中都有较好的准确度和精密度。通过本专利技术的方法可以有效地从菌渣中提取林可霉素，尽最大可能降低菌渣中其他杂质对后续检测的影响，从而提高检测的准确度(1)本专利技术首次较完善的提出超声辅助结合分散固相萃取法提取林可霉素菌渣中林可霉素的高效液相色谱法：第一步超声辅助提取林可霉素菌渣中的林可霉素，第二步分散固相萃取技术应用于提取液净化，第三步高效液相色谱-紫外检测器用于林可霉素含量的测定，此方法简单快速，准确可靠。(2)本专利技术灵敏度高，可满足我国对于林可霉素在动物性组织中的最高残留限量的检测要求，可为林可霉素菌渣资源化利用为饲料提供一定的技术依据。本专利技术方法林可霉素在100～800mg/kg添加浓度水平上回收率为82％～115％。定性检测限为0.027mg/kg，定量检测限为0.089mg/kg。日内变异系数为3％～9％，小于10％；日间变异系数为7.5％～12％，小于15％。附图说明图1为林可霉素标准曲线；图2为浓度100mg/L林可霉素的标准色谱图；图3为新鲜林可霉素菌渣中残留林可霉素色谱图。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法，它是按照以下步骤进行的：一、供试品样品制备：1)称取含有林可霉素的菌渣，加入提取剂，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液；2)称取PSA、C18和无水Na2SO4，涡旋混合1min后加入上一步的上清液，继续涡旋1min，以4000rpm/min离心10min，收集上清液，得供试品溶液；二、标准曲线绘制：用甲醇将林可霉素标准贮备液稀释成质量浓度为10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L、50mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和400mg/L标准工作溶液；采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；三、测定：吸取上述标准品工作溶液和供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算林可霉素素残留量；色谱条件：色谱柱：AglientExtend-C18柱，色谱柱内径为4.6mm，柱长250mm，填料颗粒直径为5μm，流动相：甲醇-0.05moL/L四硼酸钠十水合物按体积比为60:40混合的溶液，检测波长：214nm，进样量：10μL，流速：1mL/min，柱温：30℃。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：林可霉素菌渣与提取剂的质量体积比为1g：5～15mL。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：林可霉素菌渣与提取剂的质量体积比为1g：10mL。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：提取剂为体积百分含量为0.1％～0.15％的氨化乙腈。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五：本实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法，包括如下步骤：/n一、供试品样品制备：/n1)称取含有林可霉素的菌渣，加入体积百分含量为0.1％～0.15％的氨化乙腈提取剂，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液；/n2)称取PSA、C

【技术特征摘要】
1.一种菌渣中林可霉素残留量的检测方法，包括如下步骤：
一、供试品样品制备：
1)称取含有林可霉素的菌渣，加入体积百分含量为0.1％～0.15％的氨化乙腈提取剂，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液；
2)称取PSA、C18和无水Na2SO4，涡旋混合1min后加入上一步的上清液，继续涡旋1min，以4000rpm/min离心10min，收集上清液，得供试品溶液；
二、标准曲线绘制：
用甲醇将林可霉素标准贮备液稀释成质量浓度为10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L、50mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和400mg/L标准工作溶液；采用高效液相色谱法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准工作溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；
三、测定：吸取上述标准品工作溶液和供试品溶液注入液相色谱仪中，根据外标法计算林可霉素素残留量；
色谱条件：色谱柱：AglientExtend-C18柱，色谱柱内径为4.6mm，柱长250mm，填料颗粒直径为5μm，流动相：甲醇-0.05moL/L四硼酸钠十水合物按体积比为60:40混合的溶液，检测波长：214nm，进样量：10μL，流速：1mL/min，柱温：30℃。

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【专利技术属性】
技术研发人员：王义，张鹏，金昌福，
申请(专利权)人：宁夏希望田野生物农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏;64