一种肿瘤基因治疗中使用的融合RGD的汉坦病毒样颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及病毒基因工程领域，特别涉及一种肿瘤基因治疗中使用的融合RGD的汉坦病毒样颗粒及其制备方法。本发明专利技术选用HFRS通过基因克隆技术，在其M片段区插入RGD短肽，获得目的序列之后将其连接至原核表达载体pET‑30a上，成功构建原核表达载体pET30a‑RGD‑HFRS，将表达载体用于原核蛋白表达，表达成功后即可得融合RGD短肽的HFRS病毒样颗粒，使得当将汉坦病毒样颗粒作为基因治疗的转移载体时，能让载体更好的识别靶位肿瘤细胞，从而减少对人体正常细胞的损害，从而为实现后续肾脏疾病靶向药物的研制奠定基础。

A hantavirus like particle of fusion RGD and its preparation method used in tumor gene therapy

The present invention relates to the field of viral gene engineering, in particular to a hantavirus like particle of fusion RGD used in tumor gene therapy and a preparation method. The invention selects HFRS by gene cloning, inserted into the RGD peptide fragment of M in the area, after obtaining the objective sequence connect it to the prokaryotic expression vector pET 30a, prokaryotic expression vector pET30a RGD HFRS successfully constructed the expression vector for prokaryotic protein expression, the expression of HFRS virus like particles. To obtain the RGD peptide fusion, such that when the Hantaan virus like particles as a transfer vector for gene therapy, target recognition can make better a vector of tumor cells, thereby reducing the damage to human body cell, so as to achieve subsequent kidney disease targeted drug development foundation.

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤基因治疗中使用的融合RGD的汉坦病毒样颗粒及其制备方法
本专利技术涉及病毒基因工程领域，特别涉及一种融合RGD的汉坦病毒样颗粒及其制备方法。
技术介绍
病毒样颗粒(viruslikeparticles，VLPs)，是一种不含有病毒基因组的纳米颗粒，可由全部或部分病毒结构蛋白自组装构成，是一种非病毒载体。许多病毒结构蛋白都具有自动组装成VLPs的能力，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将外源性抗原展示在其表面。目前，至少有30种VLPs已经在文献中报道这些VLPs在生物医学各个领域发挥重要作用，大多作为疫苗载体研究，也可作为病毒感染途径研究或是作为纳米颗粒应用。汉坦病毒为单负链RNA病毒，直径为80-210nm，平均直径为120nm，呈圆形或卵圆形，有双层膜，内浆为疏松的颗粒性线状结构。汉坦病毒基因组有L、M和S三个片段，长度约6.5Kb，3.6Kb和1.7Kb，三个基因片段均由单一的长开放读码框架组成，分别以病毒RNA为模板从3’-5’方向转录相对应的mRNA(3’-5’)，然后翻译合成相对应的基因产物即病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(L)，包膜糖蛋白(G1和G2)，病毒核壳蛋白(NP)。汉坦病毒膜蛋白构成病毒最外层包膜表面镶嵌的刺突，存在血凝素抗原和中和抗原决定簇，可诱导寄主产生中和抗体，具有保护作用。肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HPS)均是由汉坦病毒属病毒引起的急性传染病。HFRS的病原体(汉坦病毒、汉城病毒、普马拉病毒和多布拉伐病毒等)主要分布于有着几千年文明历史的欧亚大陆，在国际上多称为旧世界汉坦病毒；而辛诺柏病毒、安弟斯病毒等HPS的病原体主要分布于仅有几百年文明史的南北美洲新大陆，故也称为新世界汉坦病毒。肾综合征出血热(Hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)是由汉坦病毒引起的急性病毒性传染病，以鼠类为主要传染源的自然疫源性疾病。主要表现为发热、出血、充血、低血压休克及肾脏损害。该病危害严重，病死率高，中国是世界上肾综合征出血热疫情最严重的国家，目前，对于该病尚无特异有效的治疗药物，主要靠疫苗进行预防。RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的短肽，广泛存在于生物体内，作为配体相互作用的识别位点，介导小分子核酸及细胞之间的相互作用。笔者通过反复的生物学假设和实验方法，最终得到通过使汉坦病毒样颗粒携带RGD肽作为药物靶向配体，使得当将汉坦病毒样颗粒作为基因治疗的转移载体时，能让载体更好的识别靶位肿瘤细胞，从而减少对人体正常细胞的损害，此外，利用原核表达载体降低操作难度，使该方法更好的适于工业生产。
技术实现思路
鉴于以上问题，本专利技术提供了一种携带RGD肽的汉坦病毒样颗粒，使得当将汉坦病毒样颗粒作为基因治疗的转移载体时，能让载体更好的识别靶位肿瘤细胞，从而减少对人体正常细胞的损害。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术中一种肿瘤基因治疗中使用的融合RGD的汉坦病毒样颗粒及其制备方法，所述HFRS病毒样颗粒上融合RGD短肽。优选的，所述RGD短肽插入到HFRS病毒样颗粒的M片段区。优选的，所述融合RGD短肽的HFRS病毒样颗粒是通过构建原核表达载体pET30a-RGD-HFRS原核蛋白表达获得。一种融合RGD汉坦病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：S1.mRNA的提取按照mRNA小量制备试剂盒说明书进行操作，最终根据OD260/OD280比值确定RNA的纯度和浓度；S2.逆转录反应合成cDNA按照RT-PCR试剂盒说明书操作，在冰上操作；S3.PCR扩增HFRS目的片段按照PCR试剂盒说明书操作，在冰上配制PCR反应体系；S4.双酶切配置酶切反应体系，将酶切体系在37℃孵育1h，加入10×Loadingbuffer终止反应；S5.酶切产物的连接配置10μL连接反应体系，吹打混匀连接反应液，瞬时离心将溶液收集到管底，在16℃下连接过夜；S6.重组产物鉴定经PCR和质粒双酶切的鉴定实验后，将连接产物pET-30a-HFRS进行测序鉴定；S7.PCR扩增RGD基因片段设计引物，配制PCR反应体系，置于PCR仪上；S8.重组质粒的转化解冻感受态细胞，加入连接产物，于冰上放置30min，加入预热的水浴中的LB液体培养基900μL，于37℃下，在摇床上转速为40rpm转动45～60min，弃去上清，留约100μL，缓慢吹匀，涂板，在恒温箱中于37℃下，倒置过夜培养。S9.诱导表达挑取含表达载体pET-30a质粒的大肠杆菌BL21单菌落，在LB培养基中培养至OD600值为0.4～0.6之间结束；加入100μL0.1mol·L-1IPTG，使其工作浓度为0.1mmol·L-1，恒温摇床中，25℃下250rpm，开始诱导，诱导至4h时取出菌液12,000rpm离心1min富集到离心管中，弃尽上清，加入1mL破菌缓冲液以洗涤沉淀，使用移液器彻底吹打悬浮，12,000rpm离心1min，弃尽上清，加入500μL破菌缓冲液；细胞超声破碎仪破碎后离心分离，取上清于一新的离心管中，上清液中既含有融合RGD短肽的HFRS病毒样颗粒。优选的，所述步骤S2中反应体系为：优选的，所述步骤S3中PCR反应体系为：优选的，所述步骤S3中PCR反应条件为：优选的，所述步骤S4中双酶切反应体系为：优选的，所述步骤S5中酶切产物的连接反应体系为：优选的，所述步骤S7中的PCR反应体系为：本专利技术的优点和有益效果在于：提供一种携带RGD肽的汉坦病毒样颗粒，使得当将汉坦病毒样颗粒作为基因治疗的转移载体时，能让载体更好的识别靶位肿瘤细胞，从而减少对人体正常细胞的损害，此外，制备方法中利用原核表达载体降低操作难度，使该方法更好的适于工业生产。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为原核表达载体pET30a-RGD-HFRS。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。实施例1.mRNA的提取按照mRNA小量制备试剂盒说明书进行，具体操作如下：1)向250μL经抗凝处理的血清样本中加入750μLTripureLSReagent，用移液枪反复抽打并振荡混匀，在室温裂解5min；2)将氯仿以每毫升0.2mL的比例加入到裂解液中，振荡充分使样品混匀；3)将混合物于4℃以12000r/min离心15min，使混合物分为两相，DNA和蛋白质被抽提进有机相，RNA留在水相。将上层水相转移到一个新的离心管中；4)加异丙醇与RNA沉淀液到水相中，使其充分混匀后，在室温下放置25min，以使RNA沉淀；5)以12000r/min于4℃下离心15min，去除上清，收集沉淀的RNA；6)使用75％乙醇充分洗涤沉淀，操作两次，再次重复上一步离心过程；7)室温放置，让乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合RGD的汉坦病毒样颗粒，其特征在于，所述HFRS病毒样颗粒上融合RGD短肽。

【技术特征摘要】
1.一种融合RGD的汉坦病毒样颗粒，其特征在于，所述HFRS病毒样颗粒上融合RGD短肽。2.根据权利要求1所述的一种融合RGD的汉坦病毒样颗粒，其特征在于，所述RGD短肽插入到HFRS病毒样颗粒的M片段区。3.根据权利要求1所述的一种融合RGD的汉坦病毒样颗粒，其特征在于，所述融合RGD短肽的HFRS病毒样颗粒是通过构建原核表达载体pET30a-RGD-HFRS原核蛋白表达获得。4.一种融合RGD汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.mRNA的提取按照mRNA小量制备试剂盒说明书进行操作，最终根据OD260/OD280比值确定RNA的纯度和浓度；S2.逆转录反应合成cDNA按照RT-PCR试剂盒说明书操作，在冰上操作；S3.PCR扩增HFRS目的片段按照PCR试剂盒说明书操作，在冰上配制PCR反应体系；S4.双酶切配置酶切反应体系，将酶切体系在37℃孵育1h，加入10×Loadingbuffer终止反应；S5.酶切产物的连接配置10μL连接反应体系，吹打混匀连接反应液，瞬时离心将溶液收集到管底，在16℃下连接过夜；S6.重组产物鉴定经PCR和质粒双酶切的鉴定实验后，将连接产物pET-30a-HFRS进行测序鉴定；S7.PCR扩增RGD基因片段设计引物，配制PCR反应体系，置于PCR仪上；S8.重组质粒的转化解冻感受态细胞，加入连接产物，于冰上放置30min，加入预热的水浴中的LB液体培养基900μL，于37℃下，在摇床上转速为40rpm转动45~60min，弃...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫丽丽，郝恩超，张友林，吴迪，周文静，
申请(专利权)人：宫丽丽，
类型：发明
国别省市：天津,12