一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质及其应用，实施蛋白质包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肽段；还涉及使用该蛋白质制备的检测试剂盒。通过本发明专利技术的蛋白质及试剂盒，可检测SFTS患者体内是否存在保护性抗体，判断该患者的预后情况。当本发明专利技术的试剂盒检测为阳性时，患者预后良好，都能存活，当检测结果为阴性时，患者预后不良，80％的阴性患者都死亡，可见本发明专利技术的试剂盒具有对SFTS患者具有可靠的预后判断能力。检测结果呈阳性的SFTS病人可以采取保守治疗，呈阴性的SFTS病人，应采取应急治疗。

A protein used to diagnose the prognosis of SFTS patients and its application

The invention relates to a method for diagnosis and prognosis of patients with SFTS protein and its application, the implementation of the peptide protein contains the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 shown; also relates to the use of the kit protein preparation. The protein and kit of the present invention can be used to detect the presence of protective antibodies in the SFTS patients and determine the prognosis of the patient. When the kit is positive, the patient has good prognosis and can survive. When the test results are negative, the prognosis of the patients is poor, and 80% of the negative patients are dead. Therefore, the kit of this invention has the ability of reliable prognosis for SFTS patients. SFTS patients with positive results can be treated with conservative treatment and negative SFTS patients, and emergency treatment should be taken.

【技术实现步骤摘要】
一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质及其应用
本专利技术涉及SFTS治疗和诊断领域，更特别地，涉及一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质及其应用，还涉及包含该蛋白质的ELISA检测试剂盒。
技术介绍
自2004年以来，我国多地发生了一系列发热伴出血、白细胞减少及血小板减少、多脏器受损的病例。患者多来自华中山区，农业区，流行时间为每年的4到8月份，与节肢动物活动繁殖期相吻合，病例都有明确的蜱虫叮咬里是，其发病死亡率为12％-30％。该病的其他症状有胃肠不适、纳差厌食、恶心、腹泻、疲劳乏力、相对缓脉等，实验室检查发现白细胞减少和酶学改变等，其中，丙氨酸转氨酶(alaninetransaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartateaminotransferase，AST)和肌酸激酶(creatinekinase，CK)均有升高。所述症状与感染嗜中性粒细胞无形体(anaplasmaphagocytophilum)的患者相似，但经国家疾控中心相关研究证实，该病病原体是一种新的布尼亚病毒，又称发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severefeverwiththrombocytopeniasyndromebunyavirus，sftsv)，属于布尼亚病毒科蛉热病毒属的一种新病毒。与其它布尼亚病毒科白蛉热病毒属病毒类似，sftsv是一种球形、有包膜的负链RNA病毒，直径90-100nm，基因组RNA分为大(L)、中(M)、小(s)3个节段。L节段碱基长度是6368bp，其中包含2084个氨基酸的编码框；M节段碱基长度为3378bp，其中编码两种糖蛋白(Gn、Gc)的前体；S节段长为1744bp，编码核蛋白(Nucleocapsidprotein，NP)和非结构蛋白NSs蛋白。可用于新布尼亚病毒检测或确认的方法有病毒分离、免疫荧光检测(immunofluorescenceassay，IFA)、酶联免疫吸附检测(enzyme—linkedimmunosorbentassay，ELISA)、微量中和检测(microneutralizationtest，MNT)及分子生物学方法(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT—PCR)。基于RT-PCR的检测标准已经建立，但是该方法操作复杂，依赖贵重仪器，不便于区县医院推广检测，另外RT-PCR只能说明病毒存在体内感染，不能说明病毒在体内复制状态以及既往感染水平和疫苗的保护作用。ELISA方法操作简便，不依赖贵重仪器，目前的ELISA主要是检测病毒的NP抗原以及针对NP的抗体，由于NP抗原为病毒核衣壳抗原，因此针对NP抗原的ELISA检测试剂盒确实能够给PCR检测提供印证病毒感染的方法，但不能提供体内保护抗体的水平；由于NP蛋白为核衣壳蛋白，不直接参与病毒吸附侵入感染细胞的过程，针对NP的抗体不能阻止病毒感染机体，因此检测针对NP的抗体ELISA试剂盒只能反应体内免疫系统对病毒的抗体反应，不能直接反应保护抗体的水平。
技术实现思路
专利技术人在研究过程中发现，针对GN包膜蛋白的抗体能阻止SFTSV感染细胞，具有中和活性。故推测，检测针对GN抗体的ELISA试剂盒将能显示体内保护抗体的水平，能更好的辅助临床诊断和治疗SFTSV病毒感染。为证实上述假设，专利技术人从GN蛋白中截取一段，用来检测患者血液样品中的GN抗体情况，并观察患者的病程发展情况。出乎意料地，专利技术人发现，检测结果与患者的生死密切相关，检测结果为阳性的SFTS感染者全部存活，而80％的阴性SFTS感染者死亡。基于以上发现，本专利技术提供了一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质，其包含氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的肽段。在一个优选实施方案中，所述肽段的C端连接有标签。标签的加入可在制备中有利于纯化，也可在检测过程中起鉴别作用。在一个实施方案中，所述标签肽为多聚组氨酸标签、兔Fc或荧光标记。本专利技术还提供了表达上述蛋白质的表达载体，其特征在于，包含编码所述蛋白质的核酸，以及位于所述核酸序列上游的启动子。在一个实施方案中，所述核酸中编码SEQIDNO:1所示的肽段的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。在一个实施方案中，所述表达载体的5’端还连接有编码IL2信号肽的核苷酸序列。通过添加IL2信号肽，可促进该蛋白质的分泌。本专利技术还提供了上述蛋白质在制备诊断SFTS感染者预后情况的试剂中的应用。本专利技术还提供了一种用于诊断SFTS患者预后情况的试剂盒，其中包括上述的蛋白质，以及检测所述蛋白质的抗体。在一个优选实施方案中，所述试剂盒中包含两种所述蛋白质，分别为捕获用蛋白质和检测用蛋白质，所述检测用蛋白质上具有所述捕获用蛋白质上没有的标签。捕获用蛋白质可捕获样品中的抗SFTSV抗体，检测用蛋白质可特异性结合捕获的抗SFTSV抗体，并且检测用蛋白质上的标签可用于显示该检测用蛋白质的存在与否，从而体现样品中是否存在抗SFTSV抗体。在一个具体实施方案中，所述试剂盒包括以下试剂：1)包被了所述捕获用蛋白质的固体基质，例如，可为包被0.1-10μg/mlsGN-his蛋白(即，C端加多聚组氨酸标签)于96孔酶免透明聚苯乙烯微孔板；2)封闭液，例如，可为含有5％脱脂奶粉的PBST；3)包含所述检测用蛋白质的溶液，例如，可为用封闭液稀释的工作浓度为0.1-10μg/mlsGN-rFc蛋白(即，C端加兔Fc标签)，也可是荧光标记的sGN；4)显示用试剂组，显示用试剂组用根据检测用蛋白质上的标签来设计。例如，当蛋白质为sGN-rFc时，显示用试剂组可包括偶联了HRP的羊抗兔二抗以及TMB显色底物。通过本专利技术的蛋白质及试剂盒，可检测SFTS患者体内是否存在保护性抗体，判断该患者的预后情况。当本专利技术的试剂盒检测为阳性时，患者预后良好，都能存活，当检测结果为阴性时，患者预后不良，80％的阴性患者都死亡，可见本专利技术的试剂盒具有对SFTS患者具有可靠的预后判断能力。检测结果呈阳性的SFTS病人可以采取保守治疗，呈阴性的SFTS病人，应采取应急治疗。附图说明图1为pFuse-sGN-his的质粒图；图2为pVAX1-sGN-rFc的质粒图；图3为SDS-PAGE检测纯化的sGN-his和sGN-rFc蛋白的电泳照片；图4为WB检测人血清和GN蛋白结合反应的电泳照片，1-10是康复期病人Pt1-10；12-15是死亡病人Pt12-15；N2、N4、N11是健康人,M为蛋白marker；图5为ELISA检测人血清样品的OD450nm的统计图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。从NCBI网站获取HB29SFTSV的GN蛋白序列和基因序列信息，进行序列分析，选取不同区段进行优化表达以及表达纯化实验，根据表达实验和免疫实验的结果，专利技术人出乎意料地发现，当用SEQIDNO:1所示氨基酸序列进行检测时，显示检测成阳性的患者预后良好，反之，检测结果呈阴性的患者预后不良，百分之八十的阴性患者均死亡，可见，该肽段与预后具有强烈的相关性。基于以上研究成果，本实施例提供的方案如下。1.抗原肽(Gn)的表达和纯化在SEQIDNO:1对应的核酸序列SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质，其特征在于，包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肽段。

【技术特征摘要】
1.一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质，其特征在于，包含氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的肽段。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述肽段的C端连接有标签。3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述标签肽为多聚组氨酸标签、兔Fc或荧光标记。4.权利要求1-3中任一项所述的蛋白质的表达载体，其特征在于，包含编码所述蛋白质的核酸，以及位于所述核酸序列上游的启动子。5.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述核酸中编码SEQIDNO:1所示的肽段的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。6.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的5...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴稚伟，吴喜林，马晓花，
申请(专利权)人：源道隆苏州医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32