本发明专利技术公开了HTNV GP上的CTL表位肽及其筛选方法和应用，其中，该表位肽由8个氨基酸构成：异亮氨酸‑苏氨酸‑丝氨酸‑亮氨酸‑苯丙氨酸‑丝氨酸‑亮氨酸‑亮氨酸(ITSLFSLL)，序列位置为：GPaa456～463；该表位肽的筛选方法包括以下步骤：预测‑合成‑检测；经研究，该表位肽可应用在刺激机体细胞免疫应答反应中。本发明专利技术的有益之处在于：通过对HTNV GP上的CTL表位肽的筛选和杀伤力检测，结合GP本身具有丰富的中和表位，能够刺激机体产生较强中和抗体的优势，有助于开发具有中和表位和CTL表位的新型多功能高效肽段疫苗，对HTNV新型基因工程疫苗的研究具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及汉滩病毒包膜糖蛋白(简称HTNV GP)上的CTL表位肽、该表位肽的筛选方法、以及该表位肽的应用，属于微生物免疫
技术介绍
汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)隶属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、汉坦病毒属(Hantavirus)。1976年，韩国学者李镐汪于该国疫区汉滩河流域黑线姬鼠的肺组织中首次成功分离该病毒。该病毒宿主为鼠类等啮齿类动物，主要通过动物排泄物污染而经由呼吸道、消化道及破损的皮肤等途径传播给人类，引起肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)，主要临床表现为发热、出血和急性肾功能损害。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家，具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点，据文献报道，从1950年-2007年间，我国共发生1557622例HFRS，其中死亡46427例，死亡率约为3％，而且我国的31个省自治区直辖市中有29个(新疆和西藏除外)报道发现过HFRS病例。另据中国疾病预防控制中心统计，2015年我国共发生10812例HFRS。由于HFRS的宿主广泛，传播途径多，到目前为止临床上尚缺乏特异有效的治疗药物，因此其防治任务十分艰巨。目前我国对于HFRS的预防主要采取综合预防策略，包括公共卫生安全知识的宣传和普及、鼠害的控制、流行病学调查和监督以及特 异性疫苗的研制，其中疫苗的研制和使用是预防HFRS最主要的措施，而HFRS新型基因工程疫苗的研发一直是HFRS预防领域的研究热点。在HFRS基因工程疫苗的研究中，目前主要是利用HTNV的结构蛋白，包括包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)作为抗原组分，而CTL表位诱导的细胞免疫应答在抗病毒感染中也发挥重要作用。有关HTNV结构蛋白表位研究的报道主要集中在NP和GP。现有的研究表明，HTNV NP上具有CTL表位，GP上具有中和表位和血凝表位。到目前为止，尚未有对HTNV GP上CTL表位研究的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：通过对HTNV GP上的CTL表位肽进行筛选和鉴定以及研究该表位肽在机体免疫中的应用，从而为研究HTNV新型基因工程疫苗奠定基础。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种HTNV GP上的CTL表位肽，其特征在于，所述CTL表位肽由8个氨基酸构成：异亮氨酸-苏氨酸-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸，序列位置为：GP aa456～463。一种筛选所述的HTNV GP上的CTL表位肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：从NCBI数据库获得HTNV 76-118株GP的氨基酸序列，运用生物信息学技术将这些氨基酸序列输入表位预测软件中，预测由 8个氨基酸构成的CTL表位肽，H-2b限制；Step2：依据预测的多肽序列合成相应的多肽，纯度≥98％，将合成的多肽分别溶解于DMSO中，浓度为5mg/ml，-80C保存备用；Step3：采用ELISPOT细胞因子测定试剂盒检测每条多肽刺激C57/BL6小鼠脾细胞分泌IFN-γ的水平；Step4：经检测，序列位置为GP aa456～463的多肽有效地刺激了HTNV感染后的小鼠脾细胞以及CD8+T细胞分泌IFN-γ，该条表位肽即为最终筛选出来的表位肽。本专利技术的有益之处在于：(一)筛选方法ELISPOT技术是目前检测生物体细胞免疫水平的最佳技术之一，由于它集高灵敏度、高可信度、高通量、单细胞水平、功能性检测与相对低成本等诸多优点于一身，在国内免疫学界获得了高度的认可和广泛的应用，目前已成为主流免疫学检测技术之一。CTL杀伤实验是通过间接地对乳酸脱氢酶(LDH)释放量进行定量检测，进而评估CD8+T细胞毒性，可以快速、准确的检测到早期、低水平的细胞毒性，是目前细胞免疫功能评估的常用方法。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种在功能水平上对单细胞进行定量分析和分选的检测手段，它可以快速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞分析技术之一。(二)筛选获得的表位肽该条表位肽可视为能有效刺激机体细胞免疫应答的病毒亚单位，即病毒体功能所需的高度保守区。可由此来设计多肽疫苗，这个策略的目的是接种“由明确抗原组成的最小结构”来激发有效的特异性细胞免疫应答，具备传统疫苗不可比拟的优点，而且使用安全方便，在抗病毒过程中有着广泛的应用前景。附图说明图1是HTNV GP上筛选到全部15条多肽刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ水平的ELISPOT检测结果；图2是HTNV GP上CTL表位肽(GP aa456～463)刺激小鼠脾细胞的CTL杀伤试验检测结果；图3(a)是HTNV GP上CTL表位肽(GP aa456～463)刺激小鼠脾细胞增殖的FCM检测结果；图3(b)是HTNV NP上已知的CTL表位肽刺激小鼠脾细胞增殖的FCM检测结果；图3(c)是阳性对照刺激小鼠脾细胞增殖的FCM检测结果；图3(d)是阴性对照刺激小鼠脾细胞增殖的FCM检测结果；图4(a)是HTNV GP上CTL表位肽(GP aa456～463)刺激小鼠脾细胞分化的FCM检测结果；图4(b)是HTNV NP上已知的CTL表位肽刺激小鼠脾细胞分化的FCM检测结果；图4(c)是阳性对照刺激小鼠脾细胞分化的FCM检测结果；图4(d)是阴性对照刺激小鼠脾细胞分化的FCM检测结果。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介绍。一、汉滩病毒包膜糖蛋白上的CTL表位肽的筛选方法Step1：预测从NCBI数据库获得HTNV 76-118株糖蛋白的氨基酸序列，运用生物信息学技术将这些氨基酸序列输入表位预测软件IMMUNE EPITOPE DATABASE AND ANALYSIS RESOURCE中，预测由8个氨基酸构成的CTL表位肽，H-2b限制。预测软件共计预测出HTNV GP上15条表位肽，这15条表位肽的氨基酸分别是：(1)GP aa39～46：SVIGYVEL丝氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-酪氨酸-缬氨酸-谷氨酸-亮氨酸；(2)GP aa44～51：VELPPVPL缬氨酸-谷氨酸-亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸；(3)GP aa64～71：SMDNHQSL丝氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-丝氨酸-亮氨酸；(4)GP aa208～215：IVCFFVAV异亮氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸；(5)GP aa420～427：VNFVCQRV缬氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-缬氨酸；(6)GP aa456～463：ITSLFSLL异亮氨酸-苏氨酸-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸；(7)GP aa489～496：VTFCFGWV缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-色氨酸-缬氨酸；(8)GP aa499～506：PAITFIIL脯氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-亮氨酸；(9)GP aa797～本文档来自技高网...
【技术保护点】
HTNV GP上的CTL表位肽，其特征在于，所述CTL表位肽由8个氨基酸构成：异亮氨酸‑苏氨酸‑丝氨酸‑亮氨酸‑苯丙氨酸‑丝氨酸‑亮氨酸‑亮氨酸，序列位置为：GP aa456～463。
【技术特征摘要】
1.HTNV GP上的CTL表位肽，其特征在于，所述CTL表位肽由8个氨基酸构成：异亮氨酸-苏氨酸-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸，序列位置为：GP aa456～463。2.筛选权利要求1所述的HTNV GP上的CTL表位肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：从NCBI数据库获得HTNV 76-118株GP的氨基酸序列，运用生物信息学技术将这些氨基酸序列输入表位预测软件中，预测由8个氨基酸构成的CTL表位肽，H-2b限制；Step2：依...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴兴安，王芳，程林峰，马瑞雪，张晓晓，刘梓谕，刘蓉蓉，应旗康，张芳琳，徐志凯，马铁军，于澜，张亮，叶伟，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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