固定化的聚(N)聚合酶制造技术

本发明专利技术涉及固定化的聚(N)聚合酶(PNP)、所述PNP的制备方法及其用途。进一步地公开了包括用于产生可用于基因治疗、免疫治疗、蛋白质替代疗法和/或疫苗接种的多聚核苷酸化核糖核酸(聚(N)RNA))分子的PNP的酶反应器和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】固定化的聚(N)聚合酶
本专利技术涉及固定化的聚(N)聚合酶(PNP)、产生所述PNP的方法及其用途。进一步地公开了包括用于产生可用于基因治疗、免疫治疗、蛋白质替代疗法和/或疫苗接种的多聚核苷酸化核糖核酸(聚(N)RNA))分子的PNP的酶反应器。另外，本专利技术涉及包含PNP的试剂盒。
技术介绍
基因治疗和基因疫苗接种属于现代医学中最有希望和快速发展的方法。它们可以提供高度特异性和个性化的治疗各种疾病的选择方案。特别是，遗传性遗传疾病以及自身免疫性疾病、癌性或肿瘤相关疾病和炎性疾病可以是这类治疗方法的主题。此外，设想了通过这些方法来预防这类疾病的(早期)发生。治疗性核糖核酸(RNA)分子代表着一类有希望的药物。基于RNA的治疗剂包括编码用作疫苗的抗原的信使(mRNA)分子(Fotin-Mleczek等人，2012，J.GeneMed.14(6)：428-439)。另外，设想了使用RNA分子进行替代疗法，例如，向患者提供所缺失的蛋白质，如生长因子或酶(Karikó等人，2012，Mol.Ther.20(5)：948-953；Kormann等人，2012，Nat.Biotechnol.29(2)：154-157)。此外，考虑了非编码的免疫刺激RNA分子(Heidenreich等人，IntJCancer.2014Dec21.doi：10.1002/ijc.29402.)和其它非编码RNA(如微小RNA和长非编码RNA)的治疗用途(Esteller，2011，Nat.Rev.Genet.1512(12)：861-74)。基于RNA的治疗剂表现出一些优于DNA细胞转染的性质。如通常所知的，DNA分子的转染可能导致严重的问题，如DNA整合入宿主基因组的风险，其可能影响宿主基因的表达，并且可能引发原癌基因的表达或肿瘤抑制基因的破坏。此外，通过将外源DNA整合至各个基因的编码区中，也可能使宿主需要的基因(因此编码的蛋白质)失活，如与细胞生长调节有关的基因。因此，存在许多与将DNA应用于患者相关的风险。如果使用RNA(特别是mRNA)来代替DNA，则不会发生这些风险。使用RNA而不使用DNA的另一个优点是不需要将病毒来源的启动子元件给予至体内，并且不会发生与基因组的整合。此外，RNA不需要克服细胞核的屏障。使用RNA代替DNA进行基因治疗或基因疫苗接种将不期望的基因组整合风险和抗DNA抗体的产生最小化甚至将其避免。然而，RNA是一种相当不稳定的分子物质，其在给药后可能易于被普遍存在的RNA酶降解。在体内，RNA降解影响RNA半衰期，由此其是调节真核基因表达的机制(Friedel等人，2009，NucleicAcidResearch，1-12)。取决于产生mRNA的基因，每个天然存在的mRNA具有其各自的半衰期。一方面，不稳定的RNA对于在不同时间点实现瞬时基因表达是重要的，而持久的RNA可能与不同蛋白质的积累或基因的连续表达相关。对于基因治疗和基因疫苗接种，需要稳定的RNA。这一方面是由于RNA序列编码的产物应在体内积累的事实。另一方面，在将RNA制备成合适的剂型、在其储存过程中以及在进行给药时，RNA需要保持其结构和功能完整性。这也是监管部门批准的决定性因素。据报道，核酸分子的G/C含量可能会影响其稳定性。因此，包含增加量的鸟嘌呤(G)残基和/或胞嘧啶(C)残基的核酸分子在功能上可以比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的核酸分子更稳定。在本文中，WO02/098443提供了含有通过在翻译区进行序列修饰而被稳定化的mRNA的药物组合物。这种序列修饰利用了遗传密码的简并性。因此，含有不太有利的核苷酸组合(在RNA稳定性方面不太有利)的密码子可以被替代密码子取代，而不改变编码的氨基酸序列。这种RNA稳定化的方法受到每一单个RNA分子所提供的特定核苷酸序列(不允许为所需氨基酸序列留下空间)的限制。此外，该方法仅限于RNA的编码区。作为mRNA稳定化的替代选择方案，已经发现天然存在的真核mRNA分子含有特有的稳定元件。例如，它们可以在其5'-末端(5'UTR)和/或其3'-末端(3'UTR)处包含所谓的非翻译区(UTR)以及其它结构特征，如5'-帽子结构或3'-聚(腺苷酸)尾(也称为聚(A)尾或聚(A)序列)。通常5'UTR和3'UTR两者都由基因组DNA转录而成，因此是早熟mRNA(prematuremRNA)的元件。在mRNA加工过程中，通常将成熟mRNA特有的结构特征(如5'-帽子和3'-聚(A)尾)加入到转录后的(早熟的)mRNA中。3'-聚(A)尾通常是单调的腺嘌呤核苷酸序列，其通过聚(A)聚合酶(PAP)酶催化地添加至新生mRNA的3'-端。通过普遍存在的切割/多聚腺苷酸化机制，将聚(A)序列加入到RNA分子的3'-端。在切割之后，除了复制依赖性组蛋白转录物之外，大多数前体mRNA具有多聚腺苷酸化的尾巴。在这种情况下，3'-端加工是促进mRNA从细胞核转运到细胞质中并影响mRNA的稳定性和翻译的核共转录过程。在由切割/多聚腺苷酸化机制引导的两步反应中形成该3'末端，并且该3'末端的形成取决于mRNA前体(pre-mRNA)中存在的两个序列元件：高度保守的六核苷酸AAUAAA(多聚腺苷酸化信号)和富含G/U的下游序列。在第一步中，在这两个元件之间将前体mRNA切割。在第二步中，与第一步紧密相关，通过加入由200-250个腺苷酸组成的聚(A)序列(其随后影响mRNA代谢的所有方面，包括mRNA输出、稳定性和翻译)来延伸新形成的3'末端(Dominski和Marzluff，2007，Gene396(2)：373-90。)。也可以将5’帽子结构引入至体外转录的RNA中(PascoloS.，2006，MethodsMolMed.，127：23-40)。通常，哺乳动物mRNA的聚(A)尾含有约250个腺嘌呤核苷酸。已经发现这种聚(A)尾的长度是单个mRNA稳定性的潜在关键因素。在这种情况下，Holtkamp等人报道了与具有较短聚(A)尾的mRNA相比，导致mRNA的稳定性增加和翻译效率增加的由120个核苷酸组成的聚(A)尾(Holtkamp等人，2006，Blood，第108卷，第4009-4017页)。不考虑影响mRNA稳定性的因素，由靶细胞或组织所给予的核酸分子的有效翻译，对于采用核酸分子进行基因治疗或基因疫苗接种的任何方法都是至关重要的。随着稳定性的调节，大多数mRNA的翻译也受到如UTR、5'-帽子和3'-聚(A)尾的结构特征的调节。在这种情况下，已经报道了聚(A)尾的长度可以对翻译效率起重要作用，也可以对翻译起衰减作用。据报道，3'-聚(U)尾明显地具有与3'-聚(A)尾相当的mRNA稳定性的效果(Horton和Landweber，2000，NucleicAcidsResearch，28(23)：4750-4754)。因此，可以合理地预期，聚尿苷(聚(U))尾、聚胞苷(聚(C))尾和聚鸟苷酸(聚(G))尾也具有与聚(A)尾相似的效果。如上所述，RNA通常是相当不稳定的分子物质。然而，为了将RNA作为药物使用，特别是在基因治疗、癌症免疫治疗、蛋白质替代疗法和疫苗接种领域中，需要RNA分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚(N)聚合酶，其特征在于所述聚(N)聚合酶是细菌聚(N)聚合酶并固定化在固体支持物上。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.30 EP PCT/EP2015/059611;2015.04.30 GB 15071.一种聚(N)聚合酶，其特征在于所述聚(N)聚合酶是细菌聚(N)聚合酶并固定化在固体支持物上。2.根据权利要求1所述的聚(N)聚合酶，其中所述聚(N)聚合酶选自由聚(A)聚合酶、聚(U)聚合酶、聚(G)聚合酶和聚(C)聚合酶所组成的组。3.根据权利要求1或2所述的聚(N)聚合酶，其中所述聚(N)聚合酶是聚(A)聚合酶。4.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中通过共价结合、亲和结合或物理吸附将所述聚(N)聚合酶固定化在所述固体支持物上。5.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中通过共价结合将所述聚(N)聚合酶固定化至所述固体支持物上。6.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中通过共价结合将所述聚(N)聚合酶固定化至巯基活化的固体支持物、卤代乙酰基官能化的固体支持物、环氧基官能化的固体支持物、吡啶基二硫化物官能化的固体支持物、马来酰亚胺活化的固体支持物或其混合物，优选地通过共价结合将所述聚(N)聚合酶固定化至巯基活化的固体支持物、卤代乙酰基官能化的固体支持物、吡啶基二硫化物官能化的固体支持物、马来酰亚胺活化的固体支持物或其混合物。7.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中经由至少一个半胱氨酸残基的巯基基团将所述聚(N)聚合酶固定化。8.根据权利要求4至7中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中所述共价结合是二硫桥键、硫酯键或硫醚键，优选所述共价结合是二硫桥键或硫醚键。9.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中所述固体支持物包含选自由琼脂糖凝胶、硫丙基-琼脂糖凝胶、葡聚糖、琼脂糖、二氧化硅、磁性珠粒、甲基丙烯酸酯珠粒和纳米颗粒所组成的组的成员，优选地，所述固体支持物包含选自由琼脂糖凝胶、硫丙基-琼脂糖凝胶、葡聚糖、琼脂糖、二氧化硅、磁性珠粒和纳米颗粒所组成的组的成员。10.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中所述固体支持物包含选自由巯基、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、环氧基、马来酰亚胺及其混合物所组成的组的反应性基团。11.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中所述固体支持物选自由活化的巯基琼脂糖凝胶、硫丙基-琼脂糖凝胶、巯基活化的葡聚糖、巯基活化的琼脂糖、二氧化硅基的巯基活化的基质、二氧化硅基的巯基活化的磁性珠粒、吡啶基二硫化物官能化纳米颗粒、马来酰亚胺活化的琼脂糖及其混合物所组成的组。12.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中所述聚(N)聚合酶源自大肠杆菌(Escherichiacoli)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、亚栖热菌属silvanus(Meiothermussilvanus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、栖热水生菌(Thermusaquaticus)、弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)、痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)、邦戈沙门氏菌(Salmonellabongori)、肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)、关岛特布尔西氏菌(Trabulsiellaguamensis)、抗坏血酸克吕沃尔菌(Kluyveraascorbata)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、印度格里蒙菌(Grimontiaindica)或肋生盐弧菌(Salinivibriocosticola)。13.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中所述聚(N)聚合酶包含与SEQIDNO：1至22、24至155或203中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQIDNO：1、2、3、16至22、24至155或203中任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列，更优选地与SEQIDNO:17至22、32至83、85-111、113-139、141-145、146-148、150-152、154-155或203中任一个具有至少80％同一性，甚至更优选与SEQIDNO：18、58-83、85-111、113-139或203中任一个具有至少80％同一性，且最优选与SEQIDNO:113具有至少80％同一性。14.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中与天然聚(N)聚合酶相比，所述聚(N)聚合酶包含至少一个新引入的半胱氨酸残基，优选所述聚(N)聚合酶包含SEQIDNO：17-22、32-155或203中任一个所示的氨基酸序列。15.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中所述聚(N)聚合酶仅包含一个半胱氨酸残基，或突变为仅包含一个半胱氨酸残基，优选地所述聚(N)聚合酶包含SEQIDNO：2、16-22、24-83、85-111、113-139、141-144、146-148、150-152、154-155或203中任一个所示的氨基酸序列。16.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中所述聚(N)聚合酶包含SEQIDNo：156-180所示的接头元件。17.根据前述权利要求中任一项所述的聚(N)聚合酶，其中所述聚(N)聚合酶包含SEQIDNO：181-201所示的纯化标签。18.一种产生权利要求1至17中任一项所述的聚(N)聚合酶，优选为聚(A)聚合酶的方法，包括：步骤a)在适合于通过共价结合、亲和结合或物理吸附将所述聚(N)聚合酶固定化至固体支持物的条件下，使所述聚(N)聚合酶与所述固体支持物接触。19.根据权利要求18所述的方法，其中步骤a)包括形成二硫桥键或硫醚键。20.根据权利要求18或19所述的方法，其中步骤a)包括在所述聚(N)聚合酶的半胱氨酸残基与所述固体支持物的巯基基团、卤代乙酰基基团、环氧基基团、吡啶基二硫化物或马来酰亚胺基团之间形成共价键。21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是巯基活化的固体支持物、卤代乙酰基官能化的固体支持物、吡啶基二硫化物官能化的固体支持物、环氧基活化的固体支持物或马来酰亚胺活化的固体支持物。22.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒂尔曼·鲁斯，本雅明·亚兹丹·潘纳，马库斯·康策尔曼，薇罗妮卡·瓦格纳，
申请(专利权)人：库瑞瓦格股份公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE