The invention discloses a method for fixing double functional acid urease by graphene oxide and chitosan microsphere, which belongs to the technical field of enzyme preparation. The invention uses graphene oxide and chitosan cross-linked carrier significantly increased the amount of the enzyme, and pH stability and temperature stability, to overcome the complex conditions using bifunctional acid urease, and improve the utilization rate of the enzyme, and the immobilized enzyme column convenient processing mode, convenient Yellow Wine, and volatile the material Yellow Wine in effect of urea and urethane better removal effect.
【技术实现步骤摘要】
一种氧化石墨烯和壳聚糖微球固定双功能酸性脲酶的方法
本专利技术涉及一种氧化石墨烯和壳聚糖微球固定双功能酸性脲酶的方法,属于酶制剂
技术介绍
氨基甲酸乙酯(EC)已被认定为一种致癌物质,具有多位点致癌性和基因毒性被证实广泛存在于发酵食品及酒精饮料中。在发酵酒中,EC主要有乙醇和尿素生成,因此食品和酒中EC和尿素的去除至关重要。专利技术人前期通过表达和复性获得了重组双功能酸性脲酶《ExpressionofanAcidUreasewithUrethanaseActivityinE.coliandAnalysisofUreaseGene.[J].MolecularBiotechnology,2017,59(2-3):84-97.》,能够降解尿素和EC,在酒精饮料中的酸性环境保持很高的活性,但是此酶的获得率较少,应用环境较为复杂,因此有必要对酶进行固定化,来提高酶的稳定性和回收效率,脲酶的固定化已报道,固定化方法的多种多样,但效率各有差异。壳聚糖由2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖单元以β1,4糖苷键连接而成的二元线型聚合物,壳聚糖是一种天然氨基多糖,具有良好的生物降级性、生物相容性,且无毒副作用,对环境无污染。容易进行化学改造,引入基团使其功能化,以用来固定各种各样的酶。氧化石墨烯是石墨粉经化学氧化及剥离后的产物,是单一的原子层,可以随时在横向尺寸上扩展到数十微米,经过氧化处理后,氧化石墨仍保持石墨的层状结构,但在每一层的石墨烯单片上引入了许多氧基功能团,这些氧基功能团的引入使得单一的石墨烯结构变得非常复杂,在氧化石墨烯单片上随机分布着羟基和环氧基,而在 ...
【技术保护点】
一种固定化双功能酸性脲酶的方法,其特征在于,采用戊二醛交联氧化石墨烯和壳聚糖微球制备固定化载体,用于固定双功能酸性脲酶的方法。
【技术特征摘要】
1.一种固定化双功能酸性脲酶的方法,其特征在于,采用戊二醛交联氧化石墨烯和壳聚糖微球制备固定化载体,用于固定双功能酸性脲酶的方法。2.根据权利要求1所述的一种方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一、首先进行氧化石墨烯(GO)的活化,将GO在缓冲液中超声分散,然后加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)在上述分散液中,震荡活化;然后将壳聚糖用醋酸溶液活化,按壳聚糖和氧化石墨烯质量比1:(1/3~3),将壳聚糖和氧化石墨烯载体的溶液混合反应4~12h;步骤二、通过离心获得氧化石墨烯和壳聚糖的沉淀物,加入戊二醛水溶液交联,交联时间4~12h,去离子水清洗去除为未联物质,收集沉淀物、冷冻干燥,得到固定化载体;步骤三、向氧化石墨烯/壳聚糖交联载体加入双功能酸性脲酶溶液,低温反应1~36h,分离得到加载了酶的载体。3.根据权利要求2所述的一种方法,其特征在于,戊二醛水溶液的浓度为1%~5%。4.根据权利要求2所述的一种方法,其特征在于,步骤二中交联时间4~12h。5.根据权利要求2所述的一种方法,其特征在于,步骤一、称取GO0.2g在缓冲液中,超声2h使其分散均匀,然后加入5ml0.5mMEDC和5ml0.5mM的NHS在上述分散液中,震荡2h活化,称取0.2g壳聚糖用20mL2.0%的醋酸溶液活化,震荡2h活化。6.根据权利要求2或4所述的一种方...
【专利技术属性】
技术研发人员:田亚平,刘小锋,杨柳,周楠迪,
申请(专利权)人:江南大学如皋食品生物技术研究所,江南大学,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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