一种新的人蛋白酶体亚基蛋白及其编码序列制造技术

本发明专利技术提供了一种在人体正常造血干细胞中表达的新的人ｈＰａｓ蛋白及其编码序列，本发明专利技术还提供了该蛋白和核酸序列的制备方法，以及在样品中检测人ｈＰａｓ核酸序列和多肽的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本专利技术涉及一种在人类造血干细胞中表达的hPas蛋白及其核酸序列。本专利技术还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。蛋白酶体(proteasome)是一种高分子量、对胞内绝大多数非溶酶体蛋白的降解有催化功能的蛋白酶复合物。它由一个20S(S，沉降系数，常用来表示大分子物质大小)的催化核心以及多个亚基构成。这些亚基的功能包括对胞内普遍存在的蛋白进行识别、将原本处于折叠状态的蛋白解开等等。(J Biol Chem，Vol.273，Issue15，8545-8548，April 10，1998)。本专利技术中，我们在人类造血干细胞中克隆到Sulfolobus solfataricus蛋白酶体a亚基(Proteasome alpha subunit，Pas)基因的同源基因hPas。在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的人类hPas蛋白序列及其核酸序列。本专利技术的第一目的就是提供一种新的人基因hPas(Genbank AccessionNo.AF182412)，该基因是一个人hPas蛋白基因。本专利技术的第二目的是提供一种新的人蛋白hPas。本专利技术的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述的新的人hPas蛋白和核酸序列的方法。本专利技术还提供了这种人hPas蛋白多肽和编码序列的应用。在本专利技术的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有人hPas蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第6-770位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸第6-770位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中从核苷酸第6-770位的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种分离出的人hPas蛋白质多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。在本专利技术的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。在本专利技术的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在一个实例中该宿主细胞是大肠杆菌；在另一实例中，该宿主细胞是真核细胞。在本专利技术的另一方面，还提供了一种产生具有人hPas蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下(1)将编码具有人hPas蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人hPas蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第6-770位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成人hPas蛋白的重组细胞；(3)在适合表达人hPas蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有人hPas蛋白活性的多肽。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第6-770位的序列。本专利技术还提供了与hPas蛋白多肽特异性结合的抗体。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，术语“人hPas蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人hPas蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第6-770位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的编码框第6-770位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.6中第6-770位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.7所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸第6-770位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.6中从核苷酸第6-770位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的人hPas相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本专利技术中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。在本专利技术中，术语“人hPas蛋白或多肽”指具有人hPas蛋白活性的SEQ ID NO.7序列的多肽。该术语还包括具有与天然人hPas相同功能的、SEQ ID NO.7序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人hPas蛋白的活性片段和活性衍生物。本专利技术的人hPas多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人hPas DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人hPas多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本专利技术还提供了其他多肽，如包含人hPas多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本专利技术还包括人hPas多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人hPas多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。在本专利技术中，“人hPas保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1 专利技术还包括人hPas蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人hPas多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：编码具有人ｈＰａｓ蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６中从核苷酸第６－７７０位的核苷酸序列有至少７０％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６中从核苷酸第６－７７０位的核苷酸序列杂交。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李能干，肖华胜，康柏愈，宋怀东，陈竺，韩泽广，
申请(专利权)人：国家人类基因组南方研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]