吉西他滨疗效相关基因基因多态性检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种药物吉西他滨疗效相关基因（RRM1和CDA）基因多态性检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括PCR缓冲液，特异性ARMS检测引物，质控引物。本发明专利技术还提供了一种药物吉西他滨疗效相关基因（RRM1和CDA）基因多态性检测方法。本发明专利技术方法可以快速准确地检测药物吉西他滨疗效相关基因（RRM1和CDA）基因多态性，具有灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确等特点。

Genetine gene polymorphism detection kit and detection method for gemcitabine

The invention provides a kit for detection of gemcitabine related genes (RRM1 and CDA) gene polymorphism and a detection method. The kit includes PCR buffer, specific ARMS detection primers, and quality control primers. The invention also provides a method for the detection of gene polymorphism of the gene (RRM1 and CDA) of the drug gemcitabine (gemcitabine). The method can detect the gene polymorphisms of gemcitabine related genes (RRM1 and CDA) quickly and accurately, and has the characteristics of high sensitivity, specificity, simple method and accurate result.

【技术实现步骤摘要】
吉西他滨疗效相关基因基因多态性检测试剂盒及检测方法
：本专利技术涉及生物技术及医学领域，特别是涉及药物吉西他滨疗效相关基因RRM1和CDA基因多态性检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
：吉西他滨(2’，2’-二氟-2’-去氧胞苷，dFdC)是一种破坏细胞复制的二氟核苷酸类抗代谢抗肿瘤药，也是去氧胞苷的类似物。吉西他滨对于包括胰腺癌，胆囊癌，乳腺癌和平滑肌肉瘤等在内的其他许多实体瘤具有活性。在DNA损伤修复系统中，核糖核苷酸还原酶RRM1基因扮演着重要的角色，RRM1是核苷酸结合位点，具有控制底物的特异性和整个酶活性的功能。近年来研究发现，RRM1基因在肺癌、乳腺癌、宫颈癌、食道癌、胰腺癌等许多肿瘤细胞中均有不同程度的表达。RRM1同时是核苷酸结合位点，也是核苷类似物系的化疗药物的结合位点，是第三代化疗药物吉西他滨作用的靶点之一。国外多项研究表明，RRM1表达差异与吉西他滨耐药有着密切的关系。另外，研究表明RRM1(37C>A)和(524T>C)位点的基因多态性及mRNA的表达水平与吉西他滨的疗效有关，可以做为癌症临床个体化治疗提供有效的预测因子。37AC-524CT型(高有效率基因型)RRM1低表达，肿瘤细胞DNA修复能力差，化疗疗效相对敏感。在各个吉西他滨体内代谢相关酶系中，CDA(胞苷酸脱氨酶)尤为重要，因为进入患者体内90％的吉西他滨由CDA代谢降解失活。有研究表明，CDA酶活性下降的患者更易诱发严重不良反应。而人类的CDA基因具有多态性。目前已发现的CDA基因编码区域的多态性位点有2个：A79C、G208A。其中，G208A仅存于亚洲人中，它的变异可导致CDA酶活性下降，从而改变患者的药代动力学，使吉西他滨的清除减少、体内药物暴露增多。A79C亦可降低CDA酶的活性。突变型会导致CDA酶活性减弱，使肿瘤患者在接受吉西他滨治疗时易发生更高的毒副作用在疗效方面，有研究表明，A79C的变异可引起癌症患者用药后对药物的敏感性下降、总体生存率也下降。关于基因突变检测方法有很多，各国学者对此都进行了大量研究。己经报道的方法包括直接测序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、ScorpionsARMS、TaqManPCR、ME-PCR等。这些方法各有优缺点，其中在临床和科研中较为常用的方法为直接测序法以及ARMS(Amplificationrefractorymutationsystem,扩增阻滞突变系统)法。直接测序法检测能力有限，其检测灵敏度约20％左右，而且步骤复杂，整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列的步骤，费吋费力，但是该方法的优点是能够发现一些新的未知突变。ARMS方法是将分子信标(探针)与特异性的ARMS引物相结合创造出来的，ARMS引物3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，釆用无3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶，特异性的识别引物的3’末端，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效的扩增。当引物与突变模板结合并延伸出相应的产物后，探针两端的荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光。目前，市场上相关试剂盒包括QIAGEN公司和厦门艾德公司，价格昂贵。因此，本研究釆用ARMS技术与SYBR染料相结合的方法，研发出一种拥有完全自主知识产权并且能够快速、敏感而且简便的检测RRM1(CDA)基因多态性的试剂盒。通过自己研发设计ARMS引物以及将Scorpions探针换为SYBR染料以使检测成本大大降低，这样更适合中国患者RRM1(CDA)基因多态性的检测。综上所述，该检测试剂盒及检测方法是一种灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确的RRM1(CDA)基因多态性检测方法。
技术实现思路
：本专利技术实施例的目的在于提供一种灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确的RRM1(CDA)基因多态性检测试剂盒及检测方法。本专利技术实施例是这样实现的，一种RRM1(CDA)基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，特异性突变检测引物，质控引物。本专利技术还提供一种RRM1(CDA)基因多态性检测方法，包括以下步骤：(1)提供如权利要求1中所述的引物；(2)待测样品的处理和模板的提取；(3)配制荧光定量PCR反应体系；(4)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBRGreen染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。本专利技术吉西他滨疗效相关基因(RRM1和CDA)基因多态性检测试剂盒采用SYBR染料法，建立了针对人类RRM1和CDA基因多态性(如表1所示)的多重实时PCR检测方法。本专利技术经过大量试验，研究和分析成功筛选出能够用于快速、灵敏、有效的检测吉西他滨疗效相关基因(RRM1和CDA)基因多态性的引物组合，并利用这些引物开发出具有这样的优点的用于检测吉西他滨疗效相关基因(RRM1和CDA)基因多态性的方法和试剂盒。本专利技术的检测试剂盒及检测方法具有灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确等特点，因此本专利技术具有实质性的技术效果，便与推广。表1：RRM1和CDA基因多态性形式所述的特异性引物见下表2/表3。表2：RRM1基因多态性的检测引物表3：CDA基因多态性的检测引物本专利技术涉及的检测人类RRM1和CDA基因多态性的荧光定量PCR方法不包括对待测样本的处理和模板提取的步骤，但对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的片段DNA依然具有与新鲜组织样本DNA相同的扩增和检测能力。本专利技术的检测试剂盒可在50ng野生型基因组DNA背景下准确检出1％的突变DNA，且针对性设计不同突变位点的特异性引物，使用荧光定量PCR进行检测，检测过程均为闭管反应，大大降低污染。附图说明：图1为本专利技术基因多态性检测试剂盒检测RRM1(524)样品的扩增曲线图。图2为本专利技术基因多态性检测试剂盒检测RRM1(37)样品的扩增曲线图。图3为本专利技术基因多态性检测试剂盒检测CDA(79)样品的扩增曲线图。图4为本专利技术基因多态性检测试剂盒检测CDA(208)样品的扩增曲线图。具体实施方式：以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围；在本专利技术说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种吉西他滨疗效相关基因(RRM1和CDA)基因多态性检测试剂盒，该试剂盒用于检测基因多态性的引物，各引物如下所示：

【技术特征摘要】
1.一种吉西他滨疗效相关基因(RRM1和CDA)基因多态性检测试剂盒，该试剂盒用于检测基因多态性的引物，各引物如下所示：。2.如权利1要求所述的吉西他滨疗效相关基因(RRM1和CDA)基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括3’→5’外切酶活性高保真Taq酶，1.0-5.0mM的MgCl2，1.0-5.0mM的dNTPs，即dATP，dUTP，dGTP，dCTP各1.0-5.0mM，SYBRGreenI。3.一种吉西他滨疗效相关基因(RRM1和CDA)基因多态性检测方法，包括以下步骤：(1)提供如权利要求1中所述的引物；(2)待测样品的处理和模板的提取；(3)配制荧光定量PCR反应体系；(4)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBRGreen染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYB...

【专利技术属性】
技术研发人员：田晓丽，
申请(专利权)人：宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33