单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒。所述单链核酸分子包括茎环结构区和单链区；所述茎环结构区位于所述单链核酸分子的3'端，且从5'到3'方向依次包括第一配对区、单链环区和第二配对区；所述第一配对区和第二配对区互补配对；所述单链环区为单链核苷酸序列；所述单链区为位于所述单链核酸分子5'端的单链核苷酸序列。本发明专利技术还提供了基于上述单链核酸分子的聚合酶活性测定方法及试剂盒，通过对聚合酶延伸反应终点进行荧光检测，在降低对环境压力的同时，降低了成本，简化了步骤，提高了准确性；本发明专利技术还进一步以底物的消耗量表征聚合酶活性并计算酶活，与传统酶活的定义更接近。

Single strand nucleic acid molecule, polymerase activity determination method and kit

The present invention relates to a single strand nucleic acid molecule, a polymerase activity determination method and a kit. The single stranded nucleic acid molecules including stem loop structure and single area; the area is located in the stem loop structure of single stranded nucleic acid molecules of the 3'side, and from 5' to 3'direction comprises a single chain ring region and the second region, the first pairing pairing region; the first pairing region and second complementary pairing region; the single ring region single nucleotide sequence; the single stranded region in single nucleotide sequence of the single stranded nucleic acid molecules at 5'. The invention also provides a single stranded nucleic acid molecules polymerase activity determination method and kit based on fluorescence detection was performed by the polymerase extension reaction end point, in reducing the pressure on the environment at the same time, reduce the cost, simplify the steps, improve the accuracy; the invention also further to the consumption of substrate and calculate the characterization of polymerase activity of enzyme living closer to the traditional definition of enzyme activity.

【技术实现步骤摘要】
单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒。
技术介绍
聚合酶作为一种重要的工具酶，广泛应用于基因测序、载体制备及基因克隆等一系列重要的分子生物学技术之中。目前，市场上常见的DNA聚合酶活性单位定义如下：以浓度为0.75mM的被激活的小牛胸腺DNA为模板，在反应条件为72℃，1×反应缓冲液（包含200mMTris-HCl(pH8.8)、20mMMgSO4、100mMKCl、100mM(NH4)2SO4、1%TritonX-100、1mg/mLnuclease-freeBSA），0.4MBq/mL[3H]-dTTP下反应30min，能催化10nmol的dNTP聚合生成多核苷酸片段的酶量为1单位酶活，即1U。相应的，市场上常见的聚合酶活性测定方法主要是放射性同位素标记结合凝胶电泳。但是，因为同位素存在辐射，对人体有害，在使用过程中对实验室的要求很高，实验过程中的所有试剂、耗材等均需专门处理，否则会污染环境。一般实验室、公司和研究机构均不具备进行同位素标记法实验的条件。此外，这种方法测定的活性线性范围本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单链核酸分子，其特征在于，所述单链核酸分子包括茎环结构区和单链区；所述茎环结构区位于所述单链核酸分子的3'端，且从5'到3'方向依次包括第一配对区、单链环区和第二配对区；所述第一配对区和第二配对区互补配对；所述单链环区为单链核苷酸序列；所述单链区为位于所述单链核酸分子5'端的单链核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种单链核酸分子，其特征在于，所述单链核酸分子包括茎环结构区和单链区；所述茎环结构区位于所述单链核酸分子的3'端，且从5'到3'方向依次包括第一配对区、单链环区和第二配对区；所述第一配对区和第二配对区互补配对；所述单链环区为单链核苷酸序列；所述单链区为位于所述单链核酸分子5'端的单链核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其特征在于，所述单链区为由多个重复单元组成的单链核苷酸序列，所述重复单元是长度为1-10bp的单链核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的单链核酸分子，其特征在于，所述单链区的长度为15-150bp。4.一种聚合酶活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：A、制备聚合酶延伸反应体系并进行聚合酶延伸反应，所述反应体系包括单链核酸分子、待测聚合酶、底物和适宜所述待测聚合酶发挥活性的缓冲液；B、终止聚合酶延伸反应，并通过荧光检测装置检测所述反应体系中反应产物结合双链DNA染料产生的第一荧光强度，以所述第一荧光强度表征待测聚合酶活性；所述双链DNA染料在反应体系制备时加入，或在所述聚合酶延伸反应过程中的任意时刻加入，或在所述聚合酶延伸反应终止时或终止后加入；所述单链核酸分子为权利要求1-3中任一项所述的模板-引物核酸分子；所述底物为dNTP和/或NTP。5.根据权利要求4所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述待测聚合酶为热启动聚合酶，所述聚合酶延伸反应开始前还包括热启动步骤。6.根据权利要求4所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述双链DNA染料为EvaGreen、SybrGreenI、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。7.根据权利要求4-6中任一项所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，还包括以下步骤：C、根据第二荧光强度与参照品的量的标准曲线，将所述第一荧光强度换算成参照品的量，以所述参照品的量表征待测聚合酶活性；所述参照品为由两条单链核苷酸序列完全互补配对形成的双链核酸分子，或具有茎环结构且3'端和5'端完全互补配对的单链核酸分子；所述第二荧光强度为所述参照品结合双链DNA染料产生的荧光强度。8.根据权利要求7所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，还包括以下步骤：D、将所述参照品的量换算为底物消耗量，以所述底物消耗量来表征待测聚合酶活性。9.一种聚合酶活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：A、制备一系列包括不同待测聚合酶酶量的聚合酶延伸反应体系并进行聚合酶延伸反应，所述反应体系还包括单链核酸分子、底物和适宜所述待测聚合酶发挥活性的缓冲液；B、终止聚合酶延伸反应，并通过荧光检测装置检测所述各反应体系中反应产物结合双链DNA染料产生的第一荧光强度；拟合所述第一荧光强度与所述待测聚合酶酶量之间的关系曲线，以待测聚合酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，龚敬文，
申请(专利权)人：广州康昕瑞基因健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44