一种大黄鱼的抗氧化反应指示物制造技术

本发明专利技术公开了一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，抗氧化反应指示物为Nrf2的mRNA丰度及其蛋白含量，其确定方法为：大黄鱼驯化、提取肝脏物质、RT‑PCR实时荧光定量检测，经测定，Nrf2转录因子的表达与抗氧化酶的基因表达水平存在正相关，同时Nrf2转录因子的表达与Nrf2的蛋白含量存在正相关，因此Nrf2的mRNA丰度及其蛋白含量可以作为大黄鱼的抗氧化反应指示物。有益效果为：本发明专利技术方法中大黄鱼的抗氧化指示物的确定方法简单，易于操作，而且精确度较高，大黄鱼抗氧化指示物的确定有助于通过大黄鱼考察海水中的重金属污染物，具有较高的显示意义。

【技术实现步骤摘要】
一种大黄鱼的抗氧化反应指示物
本专利技术涉及反应指示物领域，尤其是涉及一种大黄鱼的抗氧化反应指示物。技术背景氧化应激产生的活性氧ROS（reactiveoxygenspecies）直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，是众多疾病发生的病理生理基础。机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统，当暴露于亲电子试剂或活性氧刺激时，能诱导出一系列的保护性蛋白，以缓解细胞所受的损害。NF-E2相关因子2（NF-E2-relatednuclearfactor2，Nrf2）在细胞抗氧化反应中发挥重要作用。正常生理状态下，Nrf2与Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like-ECH-associatedprotein1，Keap1）大量结合并在细胞质中快速降解。一旦细胞受到应激，Nrf2与Keap1分离，进入细胞核中调控抗氧化酶相关基因的表达。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的用途，大黄鱼的抗氧化反应指示物有助于考察海水中的重金属污染情况，具有较高的现实意义。本专利技术的目的之二在于提供一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的确定方法，本抗氧化反应指示物的确定方法较为简单，精确度较高。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，大黄鱼中Nrf2转录因子的表达与Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx1a、GPx1b和GR的基因表达水平存在正相关，Nrf2转录因子的表达与Nrf2的蛋白含量也存在正相关，因此，Nrf2的mRNA丰度和蛋白含量可作为大黄鱼抗氧化反应的指示物，这有助于人们了解水中重金属离子对鱼的抗氧化反应的分子机制，进而有助于通过大黄鱼来考察海水中的重金属污染物，因此具有较高的现实意义。作为优选，确定Nrf2的mRNA丰度和蛋白含量作为大黄鱼抗氧化反应指示物的方法包括：驯化大黄鱼、提取肝脏物质、RT-PCR实时荧光定量检测，具体包括以下步骤：驯化大黄鱼：将大黄鱼在圆形玻璃缸中圈养15-20天，每天2-3次投喂商业饲料，饲料中脂质与蛋白质的干物含量分别为10-11%与48-50%，选取135条均一尺寸、重量为86-92g的大黄鱼随机分配到9个玻璃缸中，玻璃缸连续曝气，每天换水，每天维持14-15小时光照、9-10小时黑暗，水质参数如下：水温20-28℃，盐度25.5-26.5、溶氧量6.8-7.2mg/L，pH值为7.52-8.04，水质硬度为碳酸钙浓度120-125mg/L；将HgCl2加入到养殖水缸中配成含Hg溶液，Hg的含量分别为32、64μgHgL-1，取暴露在含Hg溶液中的大黄鱼浸泡在苯佐卡因中被麻醉过量致死，取肝脏样本待用；经测定，大黄鱼在急性无机汞环境下暴露96小时的半数致死率（LC50）为160μgHgL-1，在大黄鱼的拟生长环境下进行检测不仅可以精细化地测定抗氧化反应指示物的特异性，而且基于人道主义考虑，同时保护了生态；提取肝脏物质：肝脏样本被均质到10-15倍的冰冷的缓冲液中，缓冲液组成为：1.0-1.2mMEDTA、1.0-1.2mMDTT、0.5-0.6M蔗糖溶液、0.15-0.18MKCl、0.13-0.15μM（S）-4-苄基-2-唑烷酮，pH为7.6-7.8；肝脏匀浆在0-4℃下以900-1000g离心8-10分钟以沉淀大粒子，然后再次在0-4℃下以12000-14000g离心15-20分钟，收集漂浮物并于-80~-100℃保存以供生化分析；通过肝脏组织可以对铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶1a（GPx1a）、谷胱甘肽过氧化物酶1b（GPx1b）和谷胱甘肽还原酶（GR）等抗氧化酶的酶活性进行定量检测；缓冲液中的（S）-4-苄基-2-唑烷酮能够与肝脏组织中的铅离子、铜离子、汞离子等二价重金属离子形成络合物，将重金属离子从组织中分离入溶液中，同时缓冲液还可以分离肝脏样本中无用的脂肪、杂蛋白等杂质，不会对肝脏组织中各抗氧化酶与总RNA造成分解与影响，提高检测的精确度；RT-PCR实时荧光定量检测：依据TRIzol（Invitrogen）试剂盒说明进行肝脏总RNA的提取，用2-3mg总RNA作为模板，按照first-strandcDNAsynthesiskit(Fermentas)说明书合成第一链cDNA，cDNA稀释入200μL蒸馏水中；RT-PCR放大总反应体系为20μL，包含10μLSYBRPremixExTaqMasterMix(Takara)、1.98-2.03μLcDNA、0.19-0.21μM上游引物、0.19-0.21μM下游引物；按照以下程序进行PCR反应：94-95℃1分钟，其次是93-95℃5秒、55-57℃10秒、70-72℃30秒一个循环周期，循环运行45-48个周期；RT-PCR具有灵敏度高、准确性好、可操作性强的优点，可以方便地对Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx1a、GPx1b和GR等微量基因的表达进行检测并定量分析，进而分析出Nrf2与Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx1a、GPx1b、GR的相关性；经测定，如图10所示，Nrf2转录因子的表达与Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，CAT，GPx1a，GPx1b和GR的基因表达水平存在正相关，Nrf2转录因子的表达与Nrf2的蛋白含量存在正相关，因此，Nrf2的mRNA丰度及其蛋白含量可作为大黄鱼抗氧化反应的指示物。作为优选，采用RT-PCR测定大黄鱼Nrf2基因的mRNA丰度，引物序列：F：CCCTCAAAATCCCTTTCACT，R：GCTACCTTGTTCTTGCCGC；内参基因为β-Actin，引物序列为：F：TCGTCGGTCGTCCCAGGCAT，R：ATGGCGTGGGGCAGAGCGT；所用引物序列详见图1。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1）缓冲液中的（S）-4-苄基-2-唑烷酮能够与肝脏组织中的铅离子、铜离子、汞离子等二价重金属离子形成络合物，将重金属离子从组织中分离入溶液中，同时缓冲液还可以分离肝脏样本中无用的脂肪、杂蛋白等杂质，不会对肝脏组织中的总RNA造成分解与影响，提高检测的精确度；2）本专利技术方法中大黄鱼的抗氧化指示物的确定方法简单，易于操作，而且精确度较高，大黄鱼抗氧化指示物的确定有助于人们了解水中重金属离子对鱼的抗氧化反应的分子机制，进而有助于通过大黄鱼考察海水中的重金属污染情况，具有较高的现实意义。附图说明图1是本专利技术中所用到的引物序列；图2是本专利技术中Hg作用后缓冲液对Nrf2基因的mRNA相对表达水平的影响；图3是本专利技术中Hg作用后MDA与GSH的含量示意图；图4是本专利技术中Hg作用后SOD与CAT的酶活性图；图5是本专利技术中Hg作用后GPx与GR的酶活性图；图6是本专利技术中Hg作用后GST的酶活性图；图7是本专利技术中Hg作用后Cu/Zn-SOD与Mn-SOD的基因相对表达图；图8是本专利技术中Hg作用后CAT与GPx1a的基因相对表达图；图9是本专利技术中Hg作用后GPx1b与GR的基因相对表达图；图10是本专利技术中Hg作用后Nrf2与Keap1的基因相对表达图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的用途，其特征在于：所述大黄鱼的抗氧化反应指示物用于考察海水中的重金属污染情况的用途。

【技术特征摘要】
1.一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的用途，其特征在于：所述大黄鱼的抗氧化反应指示物用于考察海水中的重金属污染情况的用途。2.一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的确定方法，其特征在于：具有如下步骤：驯化大黄鱼：将大黄鱼圈养15-20天，每天2-3次投喂商业饲料，选取135条尺寸均一、重量为86-92g的大黄鱼随机分配到9个玻璃缸中，将HgCl2加入到养殖水缸中配成含Hg溶液，含量分别为32、64μgHgL-1，分别取暴露于Hg环境6、12、24、48、96小时后的大黄鱼，过量麻醉致死后取肝脏样本待用；提取肝脏物质：将肝脏样本均质到10-15倍的冰冷的缓冲液中，肝脏匀浆经首次离心以沉淀大分子，经再次离心收集漂浮物保存以供生化分析；RT-PCR实时荧光定量检测：依据TRIzol（Invitrogen）试剂盒说明进行肝脏总RNA的提取，用2-3mg总RNA作为模板，按照first-strandcDNAsynthesiskit(Fermentas)说明书合成第一链cDNA，cDNA稀释入200μL蒸馏水中；RT-PCR放大反应体系为20μL，包含10μLSYBRPremixExTaqMasterMix(Takara)、1.98-2.03μLcDNA、0.19-0.21μM上游引物、0.19-0.21μM下游引物。3.根据权利要求2所述的一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，其特征在于：所述的大黄鱼驯化步骤中饲料中的脂质与蛋白质的干物含量分别为10-11%与48-50%。4.根据权利要求2所述的一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，其特征在于：所述的大黄鱼驯化步骤中的水质参数为：水温20-28℃，盐度25.5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾霖，王永红，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33