一种基因芯片上的酶标信号检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基因芯片上的酶标信号检测方法。其步骤是制作基因芯片；构建芯片生化反应室，进行芯片生化反应，在反应过程中引入生物素；生化反应完成后采用碱性磷酸酶复合物进行芯片信号检测。在信号检测过程中，优化了反应条件，简化了反应步骤，提高了信号检测的稳定性和重复性。本发明专利技术核酸检测灵敏度可达０．１皮克，检测速度快，重复性和稳定性好；操作简便，成本低，易于推广应用；可进一步开发成基因芯片信号检测试剂盒。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因芯片信号检测
，具体涉及。
技术介绍
基因芯片技术大致包括四个部分样品的前期处理、芯片制作、制作后的生物学反应、信号检测。信号检测是基因芯片技术中一个不可或缺的组成部分，目前已经有多种芯片信号检测方法，主要包括荧光检测法、化学发光检测法、质谱检测法、纳米放大信号检测技术等。荧光信号检测方法是目前应用最多的基因芯片信号检测方法，普通的荧光扫描仪可以在半径100微米的区域内检测到10-18mol荧光分子，符合高密度、高通量的基因芯片信号检测的要求，但高灵敏度也带来了高背景等问题，特别是采用该方法进行基因芯片信号检测需要价格不菲等专门检测仪器；20世纪90年代后期，有研究报道通过质谱对基因芯片的信号进行检测，通过该方法可以检测到10-12-10-15mol核酸分子，所获得的信号检测结果精确度高，但采用该方法需要质谱仪，操作复杂，目前仅限制在有关的科研院校中使用；采用化学发光信号检测方法检测核酸需要对核酸进行相关化学修饰，而且必需专门的信号检测仪器，因而该方法在基因芯片信号检测应用上的报道较少；随着纳米技术的发展以及纳米技术与生物技术的相互融合，近几年出现了一种基因芯片上的纳米放大信号检测技术，有文献报道用纳米金进行信号检测，结合银染方法，核酸检测灵敏度可高出荧光检测方法两个数量级，但该方法尚处于发展初期，离实用化还有一定距离。综上所述，研究者们一直在为寻找实用化的基因芯片信号检测方法而努力，但以上几种方法都难以实现实用化这一目标。2002年，首次出现了酶标信号检测技术在基因芯片上应用的文献报道。酶标信号检测技术是目前应用最广泛的传统的信号检测技术之一，其基本技术流程为在待检测的核酸中掺入半抗原生物素；通过化学交联方法将亲和素(或链霉亲和素)与信号检测用酶(碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等)交联在一起；用交联产物亲和素-碱性磷酸酶(或辣根过氧化物酶等)进行信号检测，利用亲和素(链霉亲和素)与核酸中的生物素的特异性作用将信号检测用酶引入核酸，酶催化底物(如5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氯化硝基四氮唑蓝混合液)产生颜色反应。与荧光等方法相比较而言，该方法信号检测灵敏度相对较低，因此很难在高密度基因芯片上进行应用；但其核酸检测灵敏度可达1-5皮克，能够满足中低密度基因芯片(≤400点/cm2)信号检测的要求，而且该方法操作简便，可根据颜色的有无判断生化反应的结果，结合简易型信号检测仪即可进行定量或半定量分析，易于推广应用；2000年，本研究室邵文海等人报道了一种可定向交联碱性磷酸酶与链霉亲和素的方法(Wen-Hai Shao et al.，Anchor-Chain Molecular System forOrientation Control in Enzyme Immobilization.Bioconjugate Chem.2000，11，822-826)，通过该方法实现了碱性磷酸酶与链霉亲和素(Straptactin)的定向交联。采用碱性磷酸酶-连接肽-链霉结合肽(II型)融合蛋白与链霉亲和素的定向交联复合物进行酶标信号检测，核酸检测灵敏度可达0.1皮克(图2)，信号检测的稳定性和重复性也有很大提高。因此酶标信号检测方法可望发展成为实用化的中低密度基因芯片信号检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。首先制作好有关基因芯片，并进行芯片生化反应，在反应过程中引入生物素；芯片生化反应结束后，采用碱性磷酸酶-亲和素复合物或自行制备的碱性磷酸酶-连接肽-链霉结合肽-链霉亲和素复合物进行信号检测；在信号检测过程中，对酶标信号检测方法的反应条件进行优化，简化反应步骤，提高了信号检测的稳定性和重复性；通过采用自行制备的碱性磷酸酶-连接肽-链霉结合肽-链霉亲和素定向交联复合物进行信号检测，提高了信号检测灵敏度。为达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施。首先根据以下步骤制作基因芯片并进行芯片PCR等生化反应，在反应过程中引入生物素A)首先通过氢氟酸蚀刻，在普通载玻片上制作点阵；其次对载玻片进行巯基硅烷化修饰；B)合成相关引物，对引物的5’末端进行二硫键修饰；通过二硫键修与巯基的交换反应将引物固定于载玻片，形成引物阵列；至此基因芯片制作完毕；C)在基因芯片上构建生化反应室，进行芯片PCR等生化反应，在反应过程中引入生物素。芯片PCR等生化反应结束后，采用碱性磷酸酶-亲和素复合物或碱性磷酸酶-连接肽-链霉结合肽-链霉亲和素复合物，按下述步骤进行芯片信号检测a)用溶液I(10mM Tris-HCl，pH7.5；150mM NaCl，0.05％Tween-20)37℃漂洗芯片5分钟，洗去非特异性结合的核酸；b)以溶液II(100mM Tris-HCl，pH7.5；150mMNaCl，50mg/ml BSA)37℃封阻芯片10分钟，防止信号检测酶的非特异性吸附；c)碱性磷酸酶-亲和素复合物或碱性磷酸酶-连接肽-链霉结合肽-链霉亲和素复合物在芯片上37℃作用10分钟，使复合物中的亲和素或链霉亲和素与芯片上DNA中的生物素充分作用；d)以溶液I 37℃漂洗芯片两次，每次10分钟，除去非特异性吸附的碱性磷酸酶复合物；e)在芯片上滴加5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)/氯化硝基四氮唑蓝(NBT)混合液，其中BCIP与NBT的终浓度均为200微克/毫升，于37℃下反应，30分钟以内出现蓝紫色阳性反应结果。由上可知，在研究过程中，我们对酶标信号检测方法进行了以下优化将酶标信号检测方法中所有步骤的反应温度恒定于37℃；配置新的通用洗脱液(溶液I)，在每个洗脱步骤中应用；省去了传统酶标信号检测过程中底物缓冲液洗涤这一步骤。通过上述手段，增加了信号检测方法的稳定性和重复性，使其更适合于中低密度基因芯片的信号检测。本专利技术与其他基因芯片信号检测技术相比，具有以下优点和效果本方法的核酸检测灵敏度可达0.1皮克，稳定性和重复性好，特别适合中低密度基因芯片的信号检测；本方法操作简便，检测速度快，整个操作流程仅需70分钟，可根据颜色的有无判断生化反应的结果，结合简易型信号检测仪即可进行定量或半定量分析，因此本专利技术易于推广应用，可进一步开发成基因芯片信号检测试剂盒。附图说明图1.优化后酶标信号检测方法的灵敏度检验结果a为阳性对照，采用商品化碱性磷酸酶作为信号检测用酶；B为采用定向交联产物进行信号检测所得结果；I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX，分别对应不同DNA(掺入生物素)量25纳克、5纳克、1纳克、100皮克、50皮克、10皮克、0.5皮克、0.1皮克；X为阴性对照。图2.芯片PCR电泳结果 M为DNA Marker DL-20001号泳道为芯片PCR液相产物；2号泳道和3号泳道均为玻片PCR扩增产物，2号掺入生物素，3号未掺入生物素。图3.芯片半巢式PCR酶标信号检测结果采用优化后酶标方法进行信号检测； 为阳性对照，点加未经二硫键修饰内引物； 为阳性结果。具体实施例方式实施例酶标信号检测方法检测结核菌rpoB基因芯片PCR结果。其步骤是1、对普通载玻片进行巯基硅烷化修饰后，固定rpoB基因特异性引物W10685(5’-TTTTTTTTTTAGTTCTTCGGCACCAGCCAG-3’)，形成引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因芯片上的酶标信号检测方法，该方法包括以下步骤：１）制作基因芯片并进行芯片生化反应，在反应过程中引入生物素；具体包括以下步骤：Ａ．首先在普通载玻片上制作点阵；其次对载玻片进行巯基硅烷化修饰；Ｂ．合成相关引物，对引物的５’末 端进行二硫键修饰；将修饰后引物固定于载玻片，形成引物阵列，基因芯片制作完毕；Ｃ．在基因芯片上构建生化反应室，进行芯片生化反应，在反应过程中引入生物素；２）采用碱性磷酸酶－亲和素复合物，按下述步骤进行酶标信号检测：ａ）用溶液Ⅰ３７ ℃漂洗芯片５分钟，溶液Ⅰ的组成成份为１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０；ｂ）以溶液Ⅱ３７℃封阻芯片１０分钟，溶液Ⅱ的组成成份为１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ Ｎａ Ｃｌ，５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ；ｃ）用碱性磷酸酶－亲和素复合物在芯片上３７℃作用１０分钟，使其与芯片上ＤＮＡ中的生物素充分结合；ｄ）用溶液Ⅰ３７℃漂洗芯片两次，每次１０分钟；ｅ）在芯片上滴加５－溴－４－氯－３－吲哚－磷酸／氯化硝基 四氮唑蓝混合液，３７℃下反应，３０分钟内出现蓝紫色阳性结果。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张先恩，邓教宇，黄旭，张治平，邵文海，文继开，陆红兵，刘强，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]