用于增加细胞中的谷胱甘肽水平的方法技术

本发明专利技术涉及磺基半胱氨酸和其衍生物增加细胞中的谷胱甘肽库的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增加细胞中的谷胱甘肽水平的方法本专利技术涉及磺基半胱氨酸和其衍生物增加细胞中的谷胱甘肽库(glutathionepool)的用途。谷胱甘肽，一种由氨基酸L-甘氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸(亦称为L-谷氨酸盐)组成的三肽分子，是哺乳动物中主要的细胞内抗氧化剂之一。谷胱甘肽以还原(GSH)和氧化(GSSG)状态存在，其中还原形式(GSH)占优势。增加的GSSG:GSH比率被视为表示氧化应激。尽管谷胱甘肽在大多数细胞中产生，但许多疾病和其它病理与细胞内谷胱甘肽的水平降低有关。谷胱甘肽是一种受严格调节的细胞内成分，和其产生受其通过酶γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的自身合成的负反馈抑制的限制，因此使任何过量可能性极大最小化。使用谷胱甘肽合成的前体的谷胱甘肽增加是一种经开发以解决谷胱甘肽缺乏、高氧化应激、免疫缺陷和异物过载的状态的策略，其中谷胱甘肽在所涉及的异物的解毒中起作用。在人中谷胱甘肽缺乏状态包括但不限于，HIV/AIDS、化学和感染性肝炎、肌痛性脑脊髓炎、慢性疲乏综合征、前列腺和其它癌症、白内障、阿尔茨海默病、帕金森病、慢性阻塞性肺病、哮喘、辐射中毒、营养不良状态、恶劣机体应激和衰老，和与亚最佳免疫反应有关。许多临床病理与氧化应激有关，和在许多医学参考资料中详细描述。此外，公认的是谷胱甘肽系统的缺陷导致显著的细胞衰老，和最终导致细胞发病。细胞的谷胱甘肽的浓度对抗氧化剂功能具有显著影响；营养素限制、锻炼和氧化应激对细胞的谷胱甘肽浓度具有显著影响。谷胱甘肽在一系列生物化学反应中，利用ATP、镁和三种氨基酸甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸合成。一般而言，γ-谷氨酰基半胱氨酸的合成速率决定了谷胱甘肽的合成速率，和半胱氨酸的巯基为谷胱甘肽提供了其生物学效力。因此，半胱氨酸利用率对于谷胱甘肽的利用率和其抗氧化功能是重要的。谷胱甘肽的利用率可涉及治疗应用和美容应用，还有细胞培养应用。在培养的细胞中总GSH库的增加导致细胞内区室中的氧化反应性降低，因此导致延长的培养持续时间，通常还导致效价增加。本专利技术的目的因此是发现增加细胞的GSH含量的方法。对此，主要在治疗领域中，数种方法是本领域已知的。US2014/0100283公开了GSH衍生物S-乙酰基-谷胱甘肽的用途。US2011/0077303公开了提供甘氨酸和N-乙酰基-半胱氨酸。US2013/0338165表明了某些半胱氨酸/半胱氨酸前药或N-乙酰基-半胱氨酸前药的用途。对于细胞培养应用，这样的方法可行性有限，因为谷胱甘肽前体由于需要特定的运输系统而通常不被细胞吸收。对于细胞培养，更有效和通用的方法将是有利的。已发现S-磺基半胱氨酸和其盐增加哺乳动物细胞的GSH含量。另外已发现，如果向细胞提供等量的半胱氨酸或S-磺基半胱氨酸，与接受半胱氨酸的细胞相比，已接受s-磺基半胱氨酸的细胞显示更高量的GSH。本专利技术因此涉及增加细胞中的谷胱甘肽的水平的方法，包括向所述细胞加入有效增加细胞内谷胱甘肽水平的量的S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐。在优选的实施方案中，所述方法通过以下来进行：在液体细胞培养基中培养所述细胞，和在培养的过程中在一个或多个时间点向细胞培养基加入有效增加培养物中的细胞的细胞内谷胱甘肽水平的量的S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐。在优选的实施方案中，加入(S)-2-氨基-3-磺基硫烷基丙酸钠盐。在另一优选的实施方案中，细胞培养基具有介于6.8和7.5之间的pH。在另一优选的实施方案中，S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐以使得其在细胞培养物中的浓度介于0.4和50mM之间的量加入。在一个实施方案中，细胞在至少包含一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲剂组分、一种或多种辅因子和一种或多种核酸组分的细胞培养基中培养。在一个实施方案中，本专利技术的方法通过以下进行：a)提供生物反应器；b)将待培养的细胞与包含S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐的细胞培养基混合；c)孵育步骤b)的混合物。在另一优选的实施方案中，本专利技术的方法通过以下进行：-向生物反应器中加入细胞和液体细胞培养基；-在生物反应器中孵育细胞；-在生物反应器中的细胞的整个孵育时间内连续地，或在所述孵育时间内一次或数次，向生物反应器加入细胞培养基，在此情况下所述细胞培养基是进料培养基，其中进料培养基包含S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐。优选地，进料培养基包含浓度介于1和100mmol/l之间、优选地介于5和20mmol/l之间的S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐。本专利技术还涉及S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐用于增加细胞内谷胱甘肽的量的用途。图1显示用半胱氨酸或S-磺基半胱氨酸，用在生物反应器分批进料实验中培养的CHO细胞获得的IgG浓度的比较。进一步的细节可见于实施例。图2显示用半胱氨酸或S-磺基半胱氨酸，在生物反应器分批进料实验中培养的CHO细胞的细胞内活性物质的比较。进一步的细节可见于实施例。图3显示用半胱氨酸或S-磺基半胱氨酸，在生物反应器分批进料实验中培养的CHO细胞的谷胱甘肽水平的比较。进一步的细节可见于实施例。S-磺基半胱氨酸，亦称为(S)-2-氨基-3-磺基硫烷基丙酸，是一种产物，例如通过缩合硫酸和半胱氨酸可获得的产物。合适的盐是碱金属或碱土金属盐，例如锂盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐，或其混合物。优选的是钠盐、钾盐、钙盐和镁盐，最优选的是钠盐。S-磺基半胱氨酸和其盐也可通过下式I和II显示：I其中R是和X是H、Li、Na、K、½Ca、½Mg，优选地H、Na、K。术语丙酸(propanoicacid)还可代替术语丙酸(propionicacid)使用。2-氨基-3-磺基硫烷基-丙酸，亦称为(S)-2-氨基-3-磺基硫烷基-丙酸、S-磺基-半胱氨酸或半胱氨酸-S-硫酸和其盐的合成公开于例如I.H.Segel和M.J.Johnson,AnalyticalBiochemistry5(1963),330-337和J.S.Church,D.J.Evans,SpectrochimicaActaPartA69(2008)256-262。钠盐另外可市售获自Bachem,Switzerland。细胞培养基是维持和/或支持细胞的体外生长的任何组分混合物。其可能是复合培养基或化学成分确定的培养基。细胞培养基可包含维持和/或支持细胞的体外生长所必需的所有组分，或仅一些组分，使得单独添加另外的组分。细胞培养基的实例是完全培养基，其包含维持和/或支持细胞的体外生长所必需的所有组分，以及培养基补充物或进料。完全培养基，亦称为基础培养基，通常具有介于6.8和7.8之间的pH。进料培养基优选地具有低于8.5的pH。通常，根据本专利技术的细胞培养基用于维持和/或支持在生物反应器中的细胞生长和支持所述细胞的IgG产生。一些细胞培养基作为无菌水性液体提供。液体细胞培养基的缺点是它们减少的保存期限以及运输和贮存困难。因而，目前许多细胞培养基作为细磨干粉混合物提供。它们为在水和/或水性溶液中溶解的目的而制造，并且在溶解状态下经设计，通常与其它补充物一起，为细胞提供重要的生长营养基础和/或从所述细胞产生生物药物。大多数生物药物产生平台基于分批进料细胞培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
增加细胞中的谷胱甘肽的水平的方法，包括向所述细胞加入有效增加细胞内谷胱甘肽水平的量的S‑磺基半胱氨酸和/或S‑磺基半胱氨酸盐。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.30 EP 15179065.61.增加细胞中的谷胱甘肽的水平的方法，包括向所述细胞加入有效增加细胞内谷胱甘肽水平的量的S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐。2.权利要求1的方法，特征在于所述方法通过以下进行：在液体细胞培养基中培养所述细胞，和在培养的过程中在一个或多个时间点向所述细胞培养基加入有效增加培养物中的细胞的细胞内谷胱甘肽水平的量的S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐。3.权利要求1或2的方法，特征在于加入(S)-2-氨基-3-磺基硫烷基丙酸钠盐。4.权利要求1-3中一项或多项的方法，特征在于所述细胞培养基具有介于6.8和7.5之间的pH。5.权利要求1-4中一项或多项的方法，特征在于S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐以使得它们在细胞培养物中的浓度介于0.4和50mM之间的量加入。6.权利要求1-5中一项或多项的方法，特征在于所述细胞在至少包含一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一...

【专利技术属性】
技术研发人员：A齐默，
申请(专利权)人：默克专利股份公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE