使用新模块二十二碳六烯酸(DHA)合酶生成多不饱和脂肪酸(PUFAS)制造技术

本公开关注新的模块二十二碳六烯酸(DHA)合酶和用此类合酶和一种或多种辅助蛋白遗传修饰的重组宿主生物体，所述辅助蛋白允许和/或改善宿主生物体中的PUFA生成。本公开还关注制备和使用此类生物体以及从此类生物体获得的产物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用新模块二十二碳六烯酸(DHA)合酶生成多不饱和脂肪酸(PUFAS)对相关申请的交叉引用本申请要求2015年6月6日提交的美国临时专利申请号62/172,049的优先权和申请日的权益，其公开内容在此通过提及并入本文。专利
本专利技术涉及参与PUFA，特别是DHA生成的二十碳六烯酸(DHA)合酶的分离的核酸分子和多肽。本专利技术涉及包含核酸分子的载体和宿主细胞、由核酸分子编码的多肽、包含核酸分子或多肽的组合物、以及其制备和使用方法。专利技术背景多不饱和脂肪酸(PUFA)认为可用于营养应用、药物应用、工业应用和其它目的。然而，目前从天然来源和化学合成供应PUFA不足以满足长期的商业需求。已经通过表达参与PUFA合成途径的外源基因来努力在油籽作物植物或微藻中生产PUFA。在用于PUFA合成的常规或标准途径中，通过一系列延长和去饱和反应来修饰中等链长饱和脂肪酸(脂肪酸合酶(FAS)系统的产物)。用于伸长反应的底物是脂肪酰基-CoA(要延长的脂肪酸链的活化形式)和丙二酰基-CoA(每个延长反应期间添加的两个碳的来源)。延长酶反应的产物是直链中具有两个另外的碳的脂肪酰基-CoA。去饱和酶通过在氧依赖性反应中提取两个氢而在预先存在的脂肪酸链中创建顺式双键。已经描述了用于PUFA合成的替代途径(Metz等,Science,第293卷,no.5528(2001年7月13日)，第290-293页)。此系统通过称为PUFA合酶的多域酶进行脂肪酸的从头合成。这些合酶包含与I型和II型聚酮化合物合酶(PKS)系统和II型FAS系统中发现的域或个别酶最密切相关的域。PUFA合酶是迭代的I型系统(见下面的描述)。PUFA合酶的域含量和构造代表了一种新的系统，其不适合先前描述的FAS或PKS系统。PUFA合酶途径与上文描述的延长酶/去饱和酶途径是根本不同的途径。它不参与预先制备的短链脂肪酸的修饰，并且也不需要分子氧。在一些海洋细菌中以及还在一些破囊壶菌(Thraustochytrids)中发现PUFA合成酶。破囊壶菌是真核海藻，并且假设通过侧向基因转移从细菌中获得PUFA合酶系统。已经开发了几种破囊壶菌作为富含PUFA的油的商业来源。这些油中的PUFA(主要是二十碳六烯酸(DHA,C22:6,n-3)、二十二碳五烯酸(DPAn-6,C22:5,n-6)和二十碳五烯酸(EPA,C20:5,n-3))由存在于这些生物中的PUFA合酶产生。与上文提及的破囊壶菌一样，寇氏隐甲藻(C.cohnii)已经开发成为高度富含PUFA(特别是DHA)的油的商业来源。发现DHA是此种油中大量存在的唯一PUFA，并且它可以占油中存在的总脂肪酸的50％以上。在本公开之前，尚未描述用于寇氏隐甲藻中合成DHA的酶途径。对腰鞭毛虫(dinoflagellates)中脂肪酸合成的分子遗传学的研究才开始。近来已经进行了装配和分析基因组的努力(Shoguchi等,CurrentBiology,第23卷,(2013)，第15期(2013年8月5日)，第1399-1408页)。然而，已经预测了腰鞭毛虫基因组的过度大小和特性将使遗传水平上生物合成途径的鉴定和表征至少具有挑战性(Kellmann等,Mar.Drugs第8卷,no.4(2010年3月26日),第1011-1048页)。已经报告了关于寇氏隐甲藻脂肪酸生物合成的生物化学的若干研究。发现寇氏隐甲藻不能通过已知的去饱和酶介导的和延长酶介导的途径合成DHA(Beach等,BiochimBiophysActa第369卷(1974年10月16日)，第16-24页)。还发现了基于当补料放射性标记的潜在前体时放射性标记的DHA的检测缺乏，寇氏隐甲藻不能将外部补料的脂肪酸(例如C16:0、C18:0、C18:1、C18:2和C18:3)转化为DHA(Lippmeier,J.C.,Ph.D.主题名称为“FattyAcidMetabolismofMarineMicroalgae”,UniversityofHull,(2007))。在这些报告中也没有指出DHA合成的生物化学基础可以如何。在本专利技术之前尚未鉴定与DHA合成有关的基因或蛋白质。用来自标准延长酶/去饱和酶途径和来自PUFA合酶途径的蛋白质序列进行了对源自寇氏隐甲藻mRNA的EST文库的查询，但没有观察到使用任一途径的DHA合成系统的明确的遗传证据(Lippmeier,J.C.博士，主题名称为“FattyAcidMetabolismofMarineMicroalgae”,UniversityofHull,(2007),第5章)。在此，我们描述了使用生物化学和生物信息学方法的组合来鉴定与寇氏隐甲藻中的DHA合成相关的单一非常大的蛋白质。对此蛋白质中存在的酶域的分析揭示其落入称为模块I型PKS的酶类。聚酮化合物是一类具有广泛结构的(主要)次级代谢物。产生这些化合物的多域酶称为聚酮化合物合酶(PKS)。尽管PKS系统的产物差别巨大，但是它们是通过类似于脂肪酸生物合成的机制来合成的。在FAS中，延长循环由引物(乙酸单元)或更长的脂肪酰基链(其被酯化成β-酮酰基-ACP合酶(KS)的活性位点)和与酰基载体蛋白(ACP)连接的丙二酸单元之间的脱羧缩合反应启动。此反应在ACP上产生酰基链，其具有2个添加的碳(源自丙二酸单元)并且在β碳上具有酮基。在标准延长循环中，β-酮还原酶(KR，以产生β-醇基团)、脱水酶(DH，以除去水分子并且导致插入碳链中的双链)和最后烯酰还原酶(ER)的序贯作用产生完全还原的β-碳。聚酮化合物与脂肪酸生物合成之间的差异在于使用的酰基前体的数目和类型、酮基还原的程度和位置、以及随后的(PKS后)修饰。PKS系统已经在文献中描述为落入几种基本类型之一，通常称为I型(模块或迭代)、II型和III型。I型PKS系统的特征在于具有大的多域蛋白来进行产物合成所需要的酶促反应。各自进行独特类型的酶促反应的酶域进行合成。如果系统是模块I型PKS系统，则仅在终产物的生成中使用一次与延长循环相关的每个酶促域。如果该系统是迭代的I型PKS系统，则这些延长循环域中的一些多次使用以生成终产物。II型系统的特征在于可分离的蛋白质，每种蛋白质进行独特类型的酶促反应。这些酶协同起作用以生成终产物，并且系统的每种单独的酶通常多次参与生成终产物。III型系统属于植物查尔酮合酶缩合酶家族。III型PKS在迭代缩合反应中利用酰基-CoA底物以产生终产物。如上文指示，本专利技术中描述的寇氏隐甲藻DHA合酶落入称为模块I型PKS的酶类。这些系统的一个令人感兴趣的特征是，其产物结构的某些方面经常可以通过其域的存在和排列来预测。在模块类型IPKS中，这些域构造成模块-与特定的一组反应相关的域簇。在许多情况下，模块与伸长反应有关。这些模块都含有KS和ACP域，它们进行缩合反应，并且产生β-碳上具有酮基基团的伸长碳链。如果模块还含有活性KR、DH和ER域，则会完全还原β-碳。如果该模块仅含有额外的KR和DH域，则碳链中将保留双键。如果模块仅含有额外的KR域，则β-酮基将仅还原为羟基。然后，将具有酮基、或羟基、或双键、或完全还原的β-碳的伸长的碳链传递到下一个模块上。除了那些与伸长反应相关的域外，其它域经常存在于模块本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自下组：(a)核酸分子，所述核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸序列；(b)核酸分子，所述核酸分子包含编码蛋白质的多核苷酸序列，所述蛋白质具有在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，所述蛋白质具有模块二十二碳六烯酸(DHA)合酶活性；(c)核酸分子，所述核酸分子包含编码蛋白质的多核苷酸序列，所述蛋白质与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％同一性，所述蛋白质具有模块二十二碳六烯酸(DHA)合酶活性；(d)核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.06 US 62/172,0491.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自下组：(a)核酸分子，所述核酸分子包含编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸序列；(b)核酸分子，所述核酸分子包含编码蛋白质的多核苷酸序列，所述蛋白质具有在SEQIDNO:1的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，所述蛋白质具有模块二十二碳六烯酸(DHA)合酶活性；(c)核酸分子，所述核酸分子包含编码蛋白质的多核苷酸序列，所述蛋白质与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少85％同一性，所述蛋白质具有模块二十二碳六烯酸(DHA)合酶活性；(d)核酸分子，所述核酸分子包含SEQIDNO:2的多核苷酸序列。2.权利要求1的分离的核酸分子，其中由所述核酸分子编码的氨基酸序列与SEQIDNO:1是至少90％相同的。3.权利要求1的分离的核酸分子，其中由所述核酸分子编码的氨基酸序列与SEQIDNO:1是至少95％相同的。4.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含具有SEQIDNO:6的核酸序列的多核苷酸序列分子。5.权利要求1-3中任一项的分离的核酸分子，其中所述编码的蛋白质在与4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)共表达时具有模块DHA合酶活性。6.权利要求5的分离的核酸分子，其中所述PPT酶具有SEQIDNO:5的氨基酸序列。7.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含与一种或多种表达控制序列可操作连接的根据权利要求1至6中任一项的核酸分子。8.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含权利要求7的重组核酸分子。9.权利要求8的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是微生物细胞或植物细胞。10.一种经遗传修饰的生物体，其中所述生物体经遗传修饰而表达权利要求7的重组核酸分子。11.权利要求10的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体选自下组：植物、微生物和动物。12.权利要求11的经遗传修饰的生物体，其中所述微生物是微藻。13.权利要求11的经遗传修饰的生物体，其中所述微生物是细菌。14.权利要求13的经遗传修饰的生物体，其中所述微藻是破囊壶菌。15.权利要求10的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体是植物。16.权利要求10的经遗传修饰的生物体，其中所述植物是大豆或柯罗纳(Canola)。17.权利要求10至16中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述经遗传修饰的生物体包含DHA。18.权利要求10至16中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体包含至少一种选自下组的多不饱和脂肪酸(PUFA)：DPA(C22:5，n-6或n-3)、EPA(C20:5，n-3)、ARA(C20:4，n-6)、GLA(C18:3，n-6)、ALA(C18:3，n-3)、和SDA(C18:4,n-3)，其中所述核酸分子经遗传修饰，使得编码的蛋白质生成所述PUFA中的一种或多种。19.一种经遗传修饰的生物体，其中所述生物体经遗传修饰而缺失或失活由所述生物体表达的权利要求1至6中任一项的核酸分子。20.一种生成至少一种PUFA的方法，所述方法包括：在有效生成PUFA的条件下在宿主细胞中表达模块DHA合酶基因，其中所述模块DHA合酶基因包含权利要求1-6中任一项的核酸分子，并且其中生成至少一种PUFA。21.权利要求20的方法，其中所述宿主细胞选自下组：植物细胞、动物细胞和微生物细胞。22.权利要求20的方法，其中所述至少一种PUFA包含二十二碳六烯酸(DHA)。23.一种生成富集DHA的脂质的方法，所述方法包括：在有效生成脂质的条件下在宿主细胞中表达模块DHA合酶基因，其中所述模块DHA合酶基因包含权利要求1-6中任一项的核酸分子，并且其中生成富含DHA的脂质。24.一种制备重组载体的方法，所述方法包括将权利要求1-6中任一项的分离的核酸分子插入载体中。25.一种制备重组宿主细胞的方法，所述方法包括将权利要求24的重组载体导入宿主细胞中。26.权利要求25的方法，其中所述宿主细胞选自下组：植物细胞、动物细胞和微生物细胞。27.一种增加具有模块DHA合酶活性的生物体中的DHA生成的方法，所述方法包括：在有效生成DHA的条件下在所述生物体中表达权利要求1-6中任一项的核酸分子，其中所述模块DHA合酶活性替换无活性或缺失的活性，引入新活性，或者增强所述生物体中现有的活性，并且其中增加所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·G·梅斯，J·王，B·谢弗勒，R·E·泽克尔，A·贝恩，J·C·利普梅尔，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL