本发明专利技术涉及用于柑桔溃疡病菌检测的寡核苷酸引物、柑桔溃疡病菌实时荧光ＰＣＲ检测探针、固相化试剂盒及其检测方法，它是专门针对柑桔溃疡病而建立的一种快速检测方法，从制样到检出时间仅需３小时，而且检测灵敏度高、特异性强、稳定可靠。该方法不仅克服了现有的依据症状学的常规诊断方法时有误判、电镜观察法因菌体分布不均容易漏诊、单克隆抗体法因抗体制备难度大，且有非特异反应等不足；而且可以避免常规ＰＣＲ的假阴性和假阳性。固相化试剂盒操作方便，使用简单；检测方法灵敏度高、特异性强、稳定可靠；适合于进出口柑桔鲜果的口岸检疫；柑桔种苗、接穗等无症带菌材料的调运检疫检验以及非疫区柑桔黄龙病的早期预警监测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重大疫害生物柑桔溃疡病病原细菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)的实时荧光PCR固相化试剂盒及其检疫检验技术；适合于口岸检疫、农业生产、植物保护等部门使用。属于生物工程
技术介绍
柑桔溃疡病是影响全球柑桔产业发展的重大细菌性病害，也是国内外重点检疫性病害。柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)是国内外重要的检疫性有害生物；它为害数十种芸香科植物，包括柑桔属中的绝大多数商品化栽培品种，主要侵害柑桔的地上部分(叶片、枝条、皮刺、树干和果实)，虽然很少会直接杀死树木，但会导致落叶、落果、树势衰弱和果实溃疡性病斑。病害主要通过带菌种苗、接穗、果实等柑桔材料的调运进行远距离传播；田间病害主要靠病菌随风夹雨扩散。带菌衣物、包装箱及采收工具也具一定的传播可能性。据报导，美国科学家已证实，通过车辆等农用运输工具能够传播溃疡病菌，不寻常的暴风雨如热带风暴等也可引起病害的远距离传播。对于柑橘溃疡病菌的检验法有典型症状目测法、组织病理切片法、组织分离培养、致病性测定法等常规检测方法。其优点在于直观、简便易行。其中致病性测定法还可以测定活的病菌，因而可以真实地反映检疫性有害生物传播扩散的危险性。对于新发病点的确定，最终也需要通过致病性测定验证。但常规法的缺点在于检测周期长，经验不足者误判率高，不能对柑桔无症材料进行检测，难以满足植物检疫“快速、准确、经济”的基本要求。此外对柑橘溃疡病的检测还有噬菌体检验法、酶联免疫吸附法、斑点免疫吸附法等，存在过程复杂、灵敏度低、检测成本高、周期较长等问题。继常规PCR检测技术之后，新兴的实时荧光定量PCR技术凭借其对初始模板量准确定量、灵敏度高、特异性强、闭管操作、简便迅速等优点，已经成为国内外分子生物学研究中的主流技术，它同样也在植物病原体的检测和诊断中逐渐得到了广泛的使用。近年来国内外陆续开始将实时荧光PCR应用于植物病害诊断检测。实时定量荧光PCR是利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理，在PCR扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，在99.7％的置信度时计算出大于平均值的荧光值即阈值，然后收集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)。该参数和PCR反应体系中起始DNA模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线，再根据检测样品的Ct值就可以准确地测定靶标病原菌的起始模板拷贝数。实时荧光PCR根据其产生荧光的原理分为使用探针和不使用探针的两类方法。如特异性强的荧光标记探针法，可以有效避免常规PCR的假阳性问题；高灵敏度的SYBRGreen I荧光染料法可以通过熔解曲线分析验证特异性，即通过观察样品和各个对照品的熔解曲线峰值的分布情况来判断扩增曲线中荧光信号的增长是否是由靶序列的扩增引起的。实时荧光PCR检测方法用于植物病原细菌的检测，无论在国内外都还是刚刚起步，目前尚无柑桔溃疡病菌的实时荧光PCR检测试剂盒问世，而且现有的试剂盒都必须低温保存和寄送；反应试剂需要自行配制；本专利在精心优化和反复测试的基础上，研制出的可以常温储运的预混冻干固相化试剂盒，具有开启即用，标准统一、简单方便等优点。可以满足口岸调运、农业生产、植保植检部门的科研与检验检疫的快速、准确、安全的基本要求。
技术实现思路
本专利技术旨在克服上述现有技术的不足，提出快速、可靠、灵敏度高、特异性强的柑桔溃疡病菌的引物、探针、固相化试剂盒及实时荧光PCR检测方法。实现上述目的的技术方案用于柑桔溃疡病菌检测的寡核苷酸引物，包括寡核苷酸引物对5’-CGG CAG ATT GGA AGT CA-3’5’-TCC AGC ACA TAC GGG TC-3’ (序列号NO.1)；寡核苷酸引物对5’-GTT CGG CGT CAA CAA C-3’5’-CGG TAG GCG ACT CAT TT-3’ (序列号NO.2)；寡核苷酸引物对5’-GAG TCG CCT ACC GAG AAA TCC-3’5’-ACC ACG GCA GGG TGA AGA C-3’(序列号NO.3)；寡核苷酸引物对5’-CGT CAA CAA CCT GGA GAG CA-3’5’-GGT AGG CGA CTC ATT TCC CA-3’ (序列号NO.4)。本专利技术提供的一种用于柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特异性探针序列是在5’-CCA GAC AGT GTC TCG GAA ATT CGA CCT CTC CGA AC-3’两端向上游或下游位移3-6个碱基的区域内形成的核苷酸序列(探针编号NO.1)。其优化的探针序列是5’-AGT GTC TCG GAA ATT CGA CCT CTC CGA AC-3’。本专利技术提供的另一种用于柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特异性探针序列是在5’-AGC ATG CGA CGT TTC TAC CTC TCA TAC TCC CAG CC-3’两端向上游或下游位移3-6个碱基的区域内形成的核苷酸序列(探针编号NO.4)；其优化的探针序列是5’-CGA CGT TTC TAC CTC TCA TAC TCC CAG CC-3’。用于柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的荧光标记寡核苷酸探针，荧光报告基团FAM标记在5’端，而荧光淬灭基团TAMRA标记在3’端。在3’端荧光淬灭基团可以用自身不发光的Eclipse所代替。用于柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的试剂盒，包括样品提取试剂、核酸扩增固相化试剂、无害化定量标准品、健康植株阴性对照。其中使用SYBR Green I实时荧光PCR检测方法的试剂盒所使用的引物为NO.1或NO.2寡核苷酸引物对，而使用荧光标记探针实时荧光PCR检测方法的试剂盒所使用的引物为NO.3和NO.4寡核苷酸引物对，所使用的探针序列是在5’-CCA GAC AGT GTC TCG GAA ATT CGA CCT CTC CGA AC-3’两端向上游或下游位移3-6个碱基的区域内形成的核苷酸序列或者探针序列是在5’-AGC ATG CGA CGT TTC TAC CTC TCA TAC TCC CAG CC-3’两端向上游或下游位移3-6个碱基的区域内形成的核苷酸序列的荧光标记探针。柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测体系构建，包括以下步骤(1)先对柑桔溃疡病菌及其近似种或相关种进行序列比较分析，找出柑桔溃疡病菌不同于其它近似种或相关种的特有的碱基序列；(2)按照SYBR Green荧光染料法和荧光标记探针法中引物和探针的设计原理和设计方法，根据病菌的特异性核酸片段，设计柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的引物和探针；(3)对所设计的引物和探针进行筛选及反应体系和反应条件的优化，筛选出特异性引物和探针，并优化出合适的反应体系和反应条件。(4)加入权利要求1中的引物和权利要求2或4中所述的探针(SYBR Green仅需要加入引物和荧光染料即可)。(5)加入无害化阳性标准品。进行柑桔溃疡病菌实时荧光PCR反应。(6)进行实时荧光PCR反应之前，先使用试剂盒中提供的样本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于柑桔溃疡病菌检测的寡核苷酸引物，包括： 寡核苷酸引物对：５’－ＣＧＧ ＣＡＧ ＡＴＴ ＧＧＡ ＡＧＴ ＣＡ－３’ ５’－ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＣＡ ＴＡＣ ＧＧＧ ＴＣ－３’ （序列号：ＮＯ．１）； 寡核苷酸引物对：５’－ＧＴＴ ＣＧＧ ＣＧＴ ＣＡＡ ＣＡＡ Ｃ－３’ ５’－ＣＧＧ ＴＡＧ ＧＣＧ ＡＣＴ ＣＡＴ ＴＴ－３’ （序列号：ＮＯ．２）； 寡核苷酸引物对：５’－ＧＡＧ ＴＣＧ ＣＣＴ ＡＣＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＣＣ－３’ ５’－ＡＣＣ ＡＣＧ ＧＣＡ ＧＧＧ ＴＧＡ ＡＧＡ Ｃ－３’ （序列号：ＮＯ．３）； 寡核苷酸引物对：５’－ＣＧＴ ＣＡＡ ＣＡＡ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＣＡ－３’ ５’－ＧＧＴ ＡＧＧ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＴＴ ＴＣＣ ＣＡ－３’ （序列号：ＮＯ．４）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王中康，殷幼平，夏玉先，袁青，彭国雄，曾德玉，赵云，曹月青，
申请(专利权)人：重庆大学，重庆重大生物技术发展有限公司，四川渝高科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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