检测芯片的制备方法及利用该芯片检测病原体的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测芯片的制备方法，包括以下步骤：１）设计细菌的寡核苷酸探针；２）芯片制备。本发明专利技术还同时公开了利用上述检测芯片检测多个食品样本中病原体的方法，包括以下步骤：１）设计引物；２）待测样品中ＤＮＡ的提取，得提取液；３）靶基因的多重ＰＣＲ扩增；４）芯片杂交检测；５）杂交结果的检测与分析。本发明专利技术的检测方法步骤简洁、易于操作，且检测结果正确率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物检测技术，尤其是乳与乳制品中病原微生物的核酸检测技术；特别 是涉及一种可同时检测12个食品样本中病原体的方法及所用芯片。
技术介绍
食源性病原菌常造成群发性的伤害，给人们的身体健康及生命财产造成了一定的危害。 据世界卫生组织(WHO)不完全统计报告，2000年全球有210万人死于腹泻，大部分归 因于食物和饮用水中致病菌的污染。据国家卫生部统计，2000年共收到重大食物报告达 150起，导致6237人中毒、135人死亡；2001年共发生重大食物中毒事件185起，导致 15715人中毒，146人死亡。判断是否为细菌性食源性疾病的依据主要包括流行病学调査、病人的潜伏期和特有的 中毒表现以及实验室诊断，而实验室诊断能最终能确定食源性疾病的病因；所以针对食品 中病原微生物进行快速检测，能用于解决控制食品质量以及保证食品安全等这些当今的主 要问题。随着社会生产力的发展和人类社会的不断进步，食品中病原微生物的检测出现了 一些新的问题和挑战，各国和各地区政府以及相关的国际机构都出台了相应的食品检测控 制模式，随之出现了很多与之相对应的食品安全检测新技术和新方法。病原体检测技术一 直是国内和国际上研究的热点，也是食品安全监管体系的重要组成部分。传统的乳与乳制品的微生物检测采用国家标准规定的检测方法，就是将含病原菌的乳 制品涂平板，然后用培养基培养到一定程度后，在电镜、显微镜下观察，根据菌落的颜色、 形态等生化指标进行分辨。该方法优点是成本低，曾一度被认为是微生物检测的经典方法， 是后来各种检测方法的基础平台，在各个国家均被认可，但缺点也很明显，首先时间上需 要很长时间， 一般为2 — 7天；对一些表型特征变异的菌株，用传统的形态学经验很难辨 别，受主观的经验影响较大。免疫学方法中最常用的是Elisa、免疫沉淀和抗体印迹等方法，其优点是可以通过酶联 的方法将信号放大，从而检测到微量的病原体。然而免疫法依赖抗原抗体的特异性反应来 检测目的样本中的病原体，因此，实验的灵敏度很大程度上依赖于抗体的好坏 一方面，制作抗体是一个耗时耗力的工作，而且即使抗体制作的再好，也会由于抗原表面决定簇类 似的原因，使结果出现交叉反应；另一方面，有些病原变异极快，如禽流感病毒，存在很 多的亚型，并且经常变异，从而使抗体失效，不能检测新的抗原。由于免疫法是基于抗原 抗体反应的，因而，在前期样品处理过程也较为麻烦，为了检测不同的病原菌，需要用不 同的处理方法，而且不同pH值、不同浓度、不同状态的样本都会对结果产生较大的影响。 在灵敏度方面也存在一个极限， 一旦低于这个极限，免疫法就难以检测。自从PCR技术于1985年专利技术以来，由于其高度敏感性、特异性等特点使其在食品微 生物检测中得到了广泛应用，而且由此衍生出了多种方法进行检测。现在经常应用的有实 时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR和多重PCR等，它们都是针对食品中病原菌的 特异性靶基因(通常是致病基因)进行检测，而集保守性和可变性于一体的23S rRNA基 因几乎存在于所有细菌中，真细菌的16SrRNA和23SrRNA保守性非常强，被称之为"细 菌进化的活化石"。但这种保守性也是相对的，也就是说在16S rRNA和23S rRNA序列上 存在着每种细菌特异性片段，这也为细菌的检测提供了理论依据；另外16S 23S区间序 列的扩增也可以鉴别出16S不能鉴别的、非常接近的菌种和种内细菌之间的鉴别。如近期 由中国检验检疫科学研究院研究成功的《猪链球菌多重PCR检测方法》在北京通过了专家 鉴定。该方法将检测猪链球菌的时间从过去的4天减少到了4小时。并首次建立了具有自 主知识产权的猪链球菌16S核糖体、荚膜多糖(CPS)的特异性引物。然而由于PCR反应非 常灵敏，容易因污染而导致假阳性结果。并且，每次PCR或real time PCR只能对1种基 因成分进行检测，效率低，周期长。基因芯片具有高通量检测的优点，仅靠一个实验就能检测出大量的未知菌，所以基因 芯片技术在微生物研究领域的成功经验为其应用于食品微生物特别是致病菌的检测打下 了基础。目前也已经有部分用于食品检测的芯片，然而，这些芯片也有以下一些缺点和不 足1、虽然能做到高通量检测病原，但一般一张芯片只能检测一种样本的所有病原体；2、 荧光标记目前一般有两种， 一种是在扩增的同时加入Cy-dCTP，但由于Cy是一个大分子， 空间位阻较大，因此在链延伸过程中不容易结合上去；另一种方法是先合成带荧光基团的 引物，这种方法也具有较大的缺点首先，带荧光的引物不易保存，放久了就会发生荧光 淬灭；其次，合成带荧光的引物价格较贵，而且扩增不同的基因就需要不同的引物，就需 要合成许多带荧光的引物；最后，由于引物带有荧光， 一旦纯化，或洗涤步骤未做好，则 结果中会出现假阳性，或者背景信号局部很高等情况。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测芯片的制备方法及利用该芯片检测病原体 的方法，该检测方法步骤简洁、易于操作，且检测结果正确率高。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种检测芯片的制备方法，包括以下步骤-1) 、设计细菌的寡核苷酸探针每种细菌至少含两条探针，各探针利用常规软件进行设计，每条探针均必须符合以下条件长度为50 60mer， Tm值差异在5度之内，各探针内部发夹结构《5个、GC含量为 40% 55%、重复的单一碱基的连续《5个，分子最稳定的二级结构配对碱基长度少于6bp;2) 、芯片制备-将步骤l)所得的探针与Coming print buffer等体积比混合后，利用点样仪点制芯片； 将所得的芯片在预杂交液进行预杂交，再清洗、干燥后；得检测芯片。作为本专利技术的检测芯片的制备方法的改进大肠菌群的探针为SEQIDNO: 1 SEQID NO: 4中的任意一种；乳酸菌的探针为SEQIDNO: 5 SEQIDNO: 8中的任意一种；沙 门氏菌的探针为SEQIDNO: 9 SEQIDNO: 13中的任意一种；志贺氏菌的探针为SEQ ID NO: 14 SEQIDNO: 15中的任意一种；金黄色葡萄球菌的探针为SEQIDNO: 16 SEQ ID NO: 20中的任意一种；霉菌的探针为SEQIDNO: 21 SEQIDNO: 24中的任意一种； 酵母的探针为SEQIDNO: 25 SEQIDNO: 28中的任意一种。作为本专利技术的检测芯片的制备方法的进一步改进步骤2)中的预杂交液由20XSSC 100ml、 10% SDS 4ml、 10% BSA40ml和dd H20 276ml组成。本专利技术还同时提供了利用上述方法制备的芯片检测多个食品样本中病原体的方法，包括以下步骤1) 、设计引物-从数据库中获得上述每种细菌的基因组序列，然后利用常规软件设计对应每种细菌的 引物；每对引物均需符合以下条件使扩增产物在200bp左右，引物与引物之间配对碱基 长度少于6bp; CG含量为40 55。/。； Tm差异在5'C之内；2) 、待测样品中DNA的提取，得提取液；3) 、靶基因的多重PCR扩增将步骤2)的提取液做为PCR模板，分别利用步骤l)所得的引物进行多重PCR扩增； 得扩增产物；4) 、芯片杂交检测先利用荧光染料标记扩增产物；再将上述标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测芯片的制备方法，其特征是包括以下步骤：　　　　１）、设计细菌的寡核苷酸探针：　　　　每种细菌至少含两条探针，各探针利用常规软件进行设计，每条探针均必须符合以下条件：长度为５０～６０ｍｅｒ，Ｔｍ值差异在５度之内，各探针内部发夹结构≤５个、ＧＣ含量为４０％～５５％、重复的单一碱基的连续≤５个，分子最稳定的二级结构配对碱基长度少于６ｂｐ；　　　　２）、芯片制备：　　　　将步骤１）所得的探针与Ｃｏｒｎｉｎｇ　　ｐｒｉｎｔ　　ｂｕｆｆｅｒ等体积比混合后，利用点样仪点制芯片；将所得的芯片在预杂交液进行预杂交，再清洗、干燥后；得检测芯片。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：洪旭涛，杨华，陈伟光，袁谦，邵晖，项春生，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]