高纯度蛋白质的制备及其应用制造技术

一种基本上纯净的非糖基化人类白细胞介素－２蛋白质，其具有的特异活性不低于１０＋［４］单位／毫克，它是这样获取的，即培养一种带有一个ＤＮＡ的转化体，该ＤＮＡ带有一个编码人类白细胞介素－２的碱基序列，从而造成在培养肉汁中生产和积累人类白细胞介素－２，将这样获取的含有人类白细胞介素－２的液体通过包括有一个疏水性柱层析在内的提纯过程．（*该技术在2005年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是一种人白细胞介素-2及一种应用遗传工程学技术制备的方法白细胞介素-2(也称为T细胞因子，简称为IL-2)，是用同种异体抗原或外源凝集素刺激T细胞而产生的一种淋巴因子。〔科学science，193，1007(1976);免疫学评论Immunological Reviews，51，257(1980)〕。IL-2可使该细胞在体外生长，并重新获得它们的生物功能，因而有利于T细胞的长期培养。另外，据报道IL-2可促进胸腺细胞的促细胞分裂素的活性，促使裸鼠脾细胞产生T细胞依赖抗原(T细胞取代因子)，或促进杀伤细胞的分化和增殖〔免疫学杂志The Journal OF Immunology，123，2928(1979);免疫学评论Immunological Reviews，51，257(1980)〕。由于IL-2的应用已经使杀伤T细胞，辅助T细胞及自然杀伤细胞克隆化。〔自然Natural，268，154(1977)，免疫学杂志The Journal OF Immunology，130，981(1983)〕。除了直接用于T细胞或自然杀伤细胞克隆化外，IL-2还可用于选择某种抗原的特异性活的杀伤T细胞。例如在体外杀伤T细胞可以识别肿瘤抗原，并破坏肿瘤细胞。将IL-2诱导产生的特异性肿瘤杀伤细胞注射到动物体内，则可能抑制和防止肿瘤的生长〔免疫学杂志The Journal OF Immunology，125，1904(1980)〕。此外，IL-2还可以诱导IFN-Y的产生〔免疫学杂志-The Journal OF Immunology，130，1784(1983)〕以及活化自然杀伤细胞〔免疫学杂志The Journal OF Immunology，130，1970(1983)〕。上述实验资料提示IL-2是一种有前途的抗肿瘤因子。已知IL-2在缺乏胸腺细胞功能的裸鼠体内可使辅助T细胞的功能得以恢复〔欧州免疫学杂志European Jourual OF Immunology，10，719(1980)〕或恢复抗肿瘤细胞的杀伤T细胞的产生。〔自然Nature，284，278(1980)〕，因此IL-2对治疗免疫损伤疾病是很有前途的。大规模生产IL-2的方法迄今尚未成功。由于缺乏纯的IL-2，临床应用受到阻碍。人们急切盼望着能研制出一种简便、廉价、大规模生产高纯度IL-2的新技术。塔尼格其(Taniguchi)等人以人T细胞白血病细胞株Jurkat作为原材料或起始物分离到IL-2mRNA。通过使用IL-2mRNA克隆了人IL-2基因。据报道，由此可推断出人IL-2蛋白的氨基酸序列，并可在cos-7细胞中表达了这个基因〔自然Nature302，305(1983)〕。以后莱特(Later)等人报告说人类脾细胞诱导的IL-2基因已经被克隆，并可在大肠杆菌Escherichia coli中表达〔核酸研究Nucleic Acids Resarch，11，4307(1983)〕。然而到目前为止IL-2样物质的存在也仅是在TCGF活性测定的基础上而进行判断的。还没有报告说经过人IL-2的DNA密码的转录而产生的人IL-2蛋白被提纯成纯净的形式。本专利技术人已经研制出一种新技术，即利用基因控制方法对人IL-2进行克隆化，从而得到真正纯净的非糖基化的IL-2蛋白。由于使重组的DNA分子进入宿主并在其中表达人IL-2基因，而建立了生产真正纯净的、非糖基化的，人IL-2蛋白的方法并完成了目前的专利技术。本专利技术提供了真正纯净的非糖基化的人IL-2蛋白以及生产上述人IL-2蛋白的方法，它包括培养一种带有DNA的转化物，该DNA带有编码人IL-2的碱基序列，以及从培养液中提取该蛋白。本实验中所用的，编码人IL-2的DNA，是由图2中1-133密码子规定的，如DNA(Ⅰ)，该DNA(1)碱基序列在5′端可具有ATG或如图2中描述的S1-S20密码子所代表的信号序列，在3′端可能是TAA、TGA或TAG，更可能是TGA。DNA(1)倾向于连接在启动子的下方，例如色氨酸起动因子，rec A起动因子或λPL起动因子。更可能的是色氨酸起动因子和λPL起动因子。按照本专利技术，编码人IL-2的mRNA是从用刀豆球蛋白A刺激的人外周白细胞培养中分离到的。例如单链cDNA是用逆转录酶合成的，然后再合成双链DNA，随后将双链DNA插入到质体中，重新化合的质体可用于如大肠杆菌或芽胞杆菌属的枯草杆菌的转化，含有cDNA A的质体已被克隆。用这种方法可以产生编码人IL-2的双股DNA，本专利技术中所使用的编码IL-2的mRNA可用欣优曼HINUMA等人的方法得到。〔生化和生理研究通讯Biochemical and Biophscal Research Communications，109，363(1982)〕，以由此得到的人IL-2的m RNA作为模板加入已知的逆转录酶来合成cDNA，然后再将cDNA转化成双股DNA。〔曼纽尔泰斯等人，细胞Cell，8，163(1981)，兰德H等人，核酸研究Nucleic Acids Research，9，2251(1981)〕。用dG-dc同聚物连接法在限制性核酸内切酶切开的位置即PSTI将双股DNA插入到PBR322质体中。〔尼尔森，NelsonTS酶学方法Methods in Enzymology，68，41(1970)〕。此外，一个与人IL-2的部分氨基酸序列相应的低聚核苷酸可通过化学合成得到，然后以32p标记。用它作为示踪物，按照已知的克隆杂交技术在抗四环素或抗氨苄青霉素的转化物中挑选出所期待的克隆。〔格兰斯特恩Grunstein，M和霍格尼斯Hogness，D、S，Proc Natl Acad Sci USA 72 3961(1975);阿尔文Alwine，J、C等人，酶学方法Methods in Enzymology，68，220(1979)〕。按照马克西姆·吉尔伯特(Maxam-Eilbert)的方法即上述的克隆杂交法，选择出单一的克隆并分析DNA的基本序列，从而证实了人IL-2基因的存在。〔马克西姆Maxam·A·M等人，Proc·Natl·Acad·sci，USA，74，560(1977)〕。或采用噬菌体M13的二核苷酸合成链测定法〔美星Messing·G等人，核酸研究Nucleic Acids Research。9，309(1981)〕。然后从所选择的克隆中挑出完整的或部分的人IL-2基因，在适宜的起动因子和SD〔Shine和Dalgarno)序列的下方插入到质粒中，再放入一定的宿主中。在起动因子中色氨酸起动因子比较合适，而大肠杆菌(E·Coli)则适于作为宿主(例如294株，DHI株·N4 830株)。据报道E·Coli 294株〔贝克曼(Beckman)等人Proc·Natl Acad·Sci USA，73，4179(1976)〕E本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产基本上纯净的非糖基化的人类白细胞介素－２蛋白质的方法，所说的人类白细胞介素－２蛋白质的特异活性不低于１０↑〔４〕单位／毫克，其特征在于，它包括培养一种带有一种ＤＮＡ的转化物，该ＤＮＡ带有一个编码人类白细胞介素－２的碱基序列，从而造成在生长的细胞中生产和积累人类白细胞介素－２，用一种蛋白质变性剂的溶液从该细胞中提取人类白细胞介素－２，将这样所获取的含有人类白细胞介素－２的液体通过一个包括疏水性柱层析的提纯过程而纯化。

【技术特征摘要】
1.一种生产基本上纯净的非糖基化的人类白细胞介素-2蛋白质的方法，所说的人类白细胞介素-2蛋白质的特异活性不低于104单位/毫克，其特征在于，它包括培养一种带有一种DNA的转化物，该DNA带有一个编码人类白细胞介素-2的碱基序列，从而造成在生长的细胞中生产和积累人类白细胞介素-2，用一种蛋白质变性剂的溶液从该细胞中提取人类白细胞介素-2，将这样所获取的含有人类白细胞介素-2的液体通过一个包括疏水性柱层析的提纯过程而纯化。2.一种根据权项1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu GlnLeu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu AsnGly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg MetLeu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr GluLeu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys ProLeu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn PheHis Leu Arg Pro Arg As...

【专利技术属性】
技术研发人员：加藤光一，山田隆央，音田治夫，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]