具有II型磷脂酶A2抑制作用的新型单克隆抗体及含其一部分的蛋白质制造技术

本发明专利技术获得了抑制Ⅱ型磷脂酶Ａ↓［２］活性的新型单克隆抗体。该抗体抑制人Ⅱ型磷脂酶Ａ↓［２］的活性，同时也可抑制猴Ⅱ型磷脂酶Ａ↓［２］和／或小鼠Ⅱ型磷脂酶Ａ↓［２］的活性，因此不仅在临床上有用，而且也可在使用猴或小鼠的临床前试验中直接加以利用。此外，该抗体具有游离结合于细胞膜的Ⅱ型磷脂酶Ａ↓［２］的全新性质，被认为以新的机制强力抑制Ⅱ型磷脂酶Ａ↓［２］活性。本发明专利技术的单克隆抗体或含有该抗体一部分的蛋白质可用作涉及Ⅱ型磷脂酶Ａ↓［２］的心肌梗塞、脑梗塞等治疗剂。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及对II型磷脂酶A2具有强抑制活性的新型单克隆抗体及含其一部分的蛋白质。更具体地，本专利技术涉及对II型磷脂酶A2特异性、亲和性好，同时抑制II型磷脂酶A2作用强，作为涉及II型磷脂酶A2的疾病的治疗药可利用的新型单克隆抗体及含其一部分的蛋白质。本专利技术涉及产生该单克隆抗体或蛋白质的细胞，编码该单克隆抗体或蛋白质的DNA及含有该DNA的重组载体。本专利技术进一步涉及含有该单克隆抗体或蛋白质的医药组合物或II型磷脂酶A2抑制剂。
技术介绍
已知磷脂酶A2是生物膜构成成分1，2-二酰基磷酸甘油酯C2位上的酯键的水解酶。此酶见于哺乳动物的各种脏器和细胞，不仅调节生物膜磷脂的生成和代谢，而且起花生四烯酸级联反应的限速酶的作用，已知其代谢产物前列腺素、白三烯、血栓烷、PAF等具有很多生理活性。磷脂酶A2已知有I型、II型、细胞内等种类(厚味严一等，日本临床，1994年特刊，202-206)。其中，II型磷脂酶A2会伴随炎症反应进入炎症部位的渗出液，大量释放到血液中。有各种报告表明，这种酶在各种炎症性疾病中使病情恶化或成为一部分病因。例如，Kikuchi-Yanoshita等报告了在心肌梗塞模型大鼠的缺血性心脏疾病中，此酶活性的上升与脏器损害的进展相对应(Kikuchi-Yanoshita，R.et al.，J.Biochemistry，11433-38，1993)。Leong等报告了心肌梗塞患者血中存在比正常人多的此种酶(Leong，L.L et al.，Clinical ExperimentalPharmacology and Physiology，19113-118，1992)。Lauritzen等报告了在脑梗塞的缺血再灌流障碍中，本酶对疾病的恶化起了重要的作用(Lauritzen I.et al.，Brain Research，651353-356，1994)。Baur等报告了在急性肾功能衰竭中，本酶在病情的恶化上起了重要作用(Baur M.，KlinWochenschr，67196-202，1989)。Murakami等提出，该酶在哮喘等变态反应性疾病中起着中心作用，会促进肥大细胞释放组胺颗粒，抑制此酶可能开发出哮喘等变态反应性疾病的治疗药(Murakami，M.et al.，Journal of Immunology，1515675-5684，1993)。Smith等和Pruzanski等报告了慢性类风湿性关节炎患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Smith G.M.et al.，British Journal ofRheumatology，31175-178，1992；Pruzanski W.et al.，J.Rheumatol.，151351-1355，1988)。Pruzanski等报告了变形性关节炎患者渗出液中同样存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Pruzanski W.et al.，Life Sciences，482457-2462，1991)。Vadas等报告了败血性休克患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Vadas P.et al.，Life Sciences，50807-811，1992，Green J.，Inflammation，15355-367，1991)、Nevalainen等报告了胰腺炎患者、特别是重症患者的血中存在大量本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Nevalainen T.J.et al.，Gut，341133-1136，1993)。Anderson等报告了牛皮癣患者皮肤中存在大量本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Anderson S.et al.，Inflammation，181-12，1994)。Koike等报告了在多器官衰竭(MOF)中，该酶作为病因起了主要作用(Koike K.et al.，Surgery，112173-180，1992)。Koeniger等、Edelson等及Romaschin等报告了在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Koeniger R.et al.，Klin Wochenschr，67212-216，1989；Edelson J.D.et al.，AM REV RESPIRDIS，1431102-1109，1991；Romaschin A.et al.，Clin.Biochem.，255-60，1992)。Minami等报告了在克罗恩病及溃疡性大肠炎患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Minami T.et al.，Gut，33914-921，1992)。另外，据推测，眼色素层炎、新生儿呼吸窘迫综合征(RDS)、支气管肺发育异常(BPD)等疾病也与本酶有关。作为抗人II型磷脂酶A2抗体，报道了以下情况。Stoner等从人胎盘和滑液精制了人II型磷脂酶A2，将其作为抗原，用小鼠获得单克隆抗体(Stoner C.R.et al.，Journal of Immunological Methods，145127-136，1991)。此文中所用的免疫方法是将BALB/cByJ系小鼠先用与福氏完全佐剂混合的磷脂酶A25μg免疫，再在25日后用3μg免疫。进行脾细胞融合三天前(免疫36天后)以5μg最终免疫。因此，免疫的抗原全量13μg分三次、经36天进行免疫。脾细胞的融合采用小鼠骨髓瘤PAI-0细胞，选择HAT培养基。培养基上清液用磷脂酶A2经ELISA系统检测，获得单克隆抗体(PLA184、PLA185、PLA186、PLA187)。这些抗体具有对人磷脂酶A2的抑制活性。但是，对其它动物磷脂酶A2抑制活性的检测试验仅对大鼠II型磷脂酶A2进行了试验，这些抗体对大鼠II型磷脂酶A2几乎没有或完全没有交叉反应，因此不能用于大鼠动物试验。Takayama等从风湿症患者的关节液中提纯了人II型磷脂酶A2，作为免疫原，用小鼠获得了单克隆抗体(Takayama K.et al.，BIOCHEMICAL ANDBIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 1671309-1315，1990)。该文所用的免疫方法为在硝酸纤维素膜上吸附人II型磷脂酶A2 10μg后，制成匀浆，将其接种于BALB/c小鼠脾内。2周后，进行同样的免疫。从而，免疫的抗原全量20μg分两次、于28日内免疫。然后，在3天后，进行脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(X63-Ag8.6.5.3)的融合。通过使用磷脂酶A2的ELISA系统检测培养基的上清液，得到有反应性的单克隆抗体(HP-1、HP-2、HP-3、HP-4)。这些抗体中，对人磷脂酶A2抑制活性最强的为HP-1。然而，即使HP-1，其抑制活性也是弱的，即使加入200倍摩尔比的抗体，也只显示约80％的抑制活性。McCord等精制了重组人II型磷脂酶A2，将其作为免疫原，用小鼠得到单克隆抗体(McCord M.et al.，THE JOURNAL OF INVESTIGATIVEDERMATOLOGY 102980-986，1994)。该文所用本文档来自技高网...

【技术保护点】
抑制人Ⅱ型磷脂酶Ａ↓［２］活性，同时也可抑制猴Ⅱ型磷脂酶Ａ↓［２］和／或小鼠Ⅱ型磷脂酶Ａ↓［２］活性的单克隆抗体，或含其一部分、具有该抑制活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：河内康司，高崎淳，安永知荣，曾保安彦，
申请(专利权)人：山之内制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]