具有磷脂酶抑制活性的分离的肽制造技术

本发明专利技术提供了来自具有磷脂酶抑制活性的脂肪酶的Ｃ－端肽，包含磷脂酶抑制活性的多肽和能够受包含磷脂酶抑制活性的分离的肽和／或多肽抑制的脂肪酶。本发明专利技术亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，以及产生并使用具有脂肪酶抑制活性的肽和多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及脂肪酶领域。具体而言，其涉及具有磷脂酶抑制活性的分离的肽和 编码该肽的分离多核苷酸。本专利技术亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主 细胞以及产生和使用该肽的方法。其另外涉及具有磷脂酶抑制活性的多肽和能够受上述 肽和/或多肽抑制的脂肪酶。
技术介绍
脂肪酶(EC3丄1.3)水解三酰甘油的酯键并在非水系统中催化酯化和酯交换(酸 解、醇解和相互酯化)。一些脂肪酶，如磷脂酶，水解磷脂中的酯键，所述磷脂为对于 细胞膜结构和功能是极为重要的，且为膜脂质中最丰富的极性脂质。Nagao等，1998， J.Biochem.124 1124-29 描述了异孢镰孢(Fusarium heterosporum)磷脂酶的 26 个氨基酸 C-末端肽在增加所述脂肪酶的热稳定性中起重要作用，且该肽对酶活性无影响。考虑到脂质的广泛用途，例如，作为消化剂，用于在面团和面团焙烤产物中产 生味道；作为治疗剂，洗涤剂的成分，作为光学解析(optical resolution)的催化剂等，期 望有控制脂肪酶酶活性的手段。此外，从生产的角度而言，期望控制脂肪分解活性，因 为可选择制备其酶活性可再现的酶产物。
技术实现思路
本专利技术的目标是提供具有脂肪酶抑制活性的肽和编码该肽的多核苷酸，以及包 含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞和产生并使用所述肽的方法。本专利技术的 目标另外还在于提供具有脂肪酶抑制活性的多肽和能够受上述肽和/或多肽抑制的脂肪酶。本专利技术涉及具有磷脂酶抑制活性的分离的肽，选自(a)分离的肽，包含与SEQ ID NO 1的289-310残基或SEQ ID NO 9的154-175残基具有至少65%、至少70%、 至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或100%同一性的 氨基酸序列；(b)由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸在中等严格条件或高严格 条件下与SEQ ID NO 1的肽编码序列或所述SEQ ID NO 1的肽编码序列的互补链杂 交；(c)由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO: 1的289-310 残基具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%,至少97%或100%同一性的核苷酸序列；或(d)包含具有下列氨基酸序列的基序的 分离的肽M^DAXsL^XsKgl^NnX^WMX^XwDnX^EwU^K^ 其中 X4、X5、 X8、X12、X15、X16、X18和X21独立地可为任何氨基酸，其中该肽的大小小于60个氨基 酸(aa)。本专利技术亦涉及包含所述肽和脂肪酶的多肽，其中所述脂肪酶在平板测定法中具 有低于 50PHLU/mg，低于 45PHLU/mg，低于 40PHLU/mg，低于 35PHLU/mg，低于 30PHLU/mg,低于 25PHLU/mg，低于 20PHLU/mg，低于 15PHLU/mg，低于 10PHLU/ mg，低于5PHLU/mg或低于lPHLU/mg磷脂酶活性，和/或不显示磷脂酶活性。本专利技术亦涉及具有磷脂酶抑制活性的多肽，其中具有a-螺旋的至少三个溶剂 可接近的(solvent acessible)残基位于其表面的亲本蛋白质在该a-螺旋中在对应于位置 D3、L6、L10, Y13、V14、D17和X21的至少一个溶剂可接近的残基处和/或对应于该基序 的位置E7、K9、Nn、乂18和Y2(1边缘残基处经修饰。本专利技术亦涉及分离的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、包含所述肽或多 肽的重组宿主细胞，以及产生具有磷脂酶抑制活性的分离的肽或多肽的方法。本专利技术亦涉及将所述肽或多肽结合于所述脂肪酶时，所述肽或所述多肽用于抑 制脂肪酶的酶活性的用途。本专利技术亦涉及具有在平板测定法中磷脂酶活性低于50PHLU/mg，低于 45PHLU/mg,低于 40PHLU/mg，低于 35PHLU/mg，低于 30PHLU/mg，低于 25PHLU/ mg,低于 20PHLU/mg，低于 15PHLU/mg，低于 10PHLU/mg，低于 5PHLU/mg 或低于 lPHLU/mg和/或不显示磷脂酶活性的脂肪酶，其能够受所述肽抑制，其中所述脂肪酶 包含至少一个改变，所述改变独立地为插入、缺失或取代，由此在结合(a)具有磷脂酶抑 制活性的分离的肽；或(b)在所述多肽中包含的具有磷脂酶抑制活性的肽中至少之一时 所述脂肪酶的活性受到抑制。附图简述附图说明图1显示尖镰孢(F.oxysporam)磷脂酶的序列比对。图2显示a - 3和全a蛋白质序列。图3显示来自尖镰孢a螺旋的残基的溶剂可接近性(solvent accessiblility)。图4显示GZEL的晶体。图5显示GZEL晶体的代表性衍射图样。图6显示FoL PI的肽诱导改变。图7显示莫尼糖蛋白(Monellin)变体1(即MON1)和莫尼糖蛋白变体2(即 MON2)序列。图8显示对于多种肽的初始反应速率的变化。图9显示对于多种肽和脂肪酶的％抑制的变化。序列表SEQIDNO: 1:尖镰孢，FoLSEQ ID NO 2 禾谷镰孢(Fusarium Graminearium)SEQ ID NO 3 丛赤壳属(Nectria)脂肪酶 1SEQ ID NO 4 丛赤壳属脂肪酶2SEQ ID NO 5 异孢镰孢SEQ ID NO 6 半裸镰孢(Fusarium semitectum)SEQ ID NO 7 腐皮镰孢(Fusarium solani) LipCSEQ ID NO 8 腐皮镰孢 LipDSEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO 定义磷脂酶活性9:细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)，TLL 10:镶片镰孢(Fusariumvenenatum)PLA2，FVPLA2 11 菌丝霉素(plectasin) 12莫尼糖蛋白13 Protegrin14芽孢杆菌RNA酶(Barnase)15胱蛋白(Cystatins)16载脂蛋白E术语“磷脂酶活性”在本文中定义为磷脂分解(EC号3丄1.4)活 性，其将磷脂转化为脂肪酸和其他亲脂性物质。就本专利技术而言，磷脂酶活性根据在下文 段落“材料和方法”中描述的PHLU和平板测定法的步骤来确定。磷脂酶抑制活性术语“磷脂酶抑制活性”在本文中定义为抑制磷脂酶活性的 活性。本专利技术的肽具有SEQIDNO 1的成熟多肽的至少20%，至少40%，至少50%， 至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或100%的磷脂酶抑制活性。分离的肽/多肽术语“分离的肽”或“分离的多肽”在本文中分别指自源 (source)分离的肽或多肽。在某些方面，所述肽/多肽如通过SDS-PAGE或HPLC所确定 的为至少纯，至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯， 至少80 %纯或至少90 %纯。肽纯度通过HPLC确定。同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一 性”来描述。就本专利技术而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度是使用如EMBOS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有磷脂酶抑制活性的分离的肽，选自：（ａ）分离的肽，其包含与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的２８９－３１０残基或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０的１５４－１７５残基具有至少６５％、至少７０％、至少７５％、至少８０％、至少８５％、至少９０％、至少９５％、至少９７％或１００％同一性的氨基酸序列；（ｂ）由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸在中等严格条件或高严格条件下与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的肽编码序列或所述ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的肽编码序列的互补链杂交；（ｃ）由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸包含与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的２８９－３１０残基具有至少６５％、至少７０％、至少７５％、至少８０％、至少８５％、至少９０％、至少９５％、至少９７％或１００％同一性的核苷酸序列；或（ｄ）分离的肽，其包含具有下列氨基酸序列的基序：Ｍ↓［１］Ｔ↓［２］Ｄ↓［３］Ｘ↓［４］Ｘ↑［５］Ｌ↓［６］Ｅ↓［７］Ｘ↓［８］Ｋ↓［９］Ｌ↓［１０］Ｎ↓［１１］Ｘ↓［１２］Ｙ↓［１３］Ｖ↓［１４］Ｘ↓［１５］Ｘ↓［１６］Ｄ↓［１７］Ｘ↓［１８］Ｅ↓［１９］Ｙ↓［２０］Ｘ↓［２１］Ｋ↓［２２］，其中Ｘ↓［４］、Ｘ↓［５］、Ｘ↓［８］、Ｘ↓［１２］、Ｘ↓［１５］、Ｘ↓［１６］、Ｘ↓［１８］和Ｘ↓［２１］独立地可为任何氨基酸，其中该肽的大小小于６０个氨基酸（ａａ）。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2008-4-30 08155438.8;US 2008-5-5 61/050,3171.一种具有磷脂酶抑制活性的分离的肽，选自(a)分离的肽，其包含与SEQID NO 1的289-310残基或SEQ ID NO 10的 154-175残基具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、 至少95%、至少97%或100%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸在中等严格条件或高严格条件下与 SEQ IDNO 1的肽编码序列或所述SEQ ID NO 1的肽编码序列的互补链杂交；(C)由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO: 1的289-310 残基具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%,至少97%或100%同一性的核苷酸序列；或(d)分离的肽，其包含具有下列氨基酸序列的基序M1T2D3X4X5L6E7X8K9LltlN11X12Y1 I3V14X15X16D17X18E19Y20JC21IC22, X4> Χδ> Xs、Χ 2> X15、X16> X18和X21独立地可为任 何氨基酸，其中该肽的大小小于60个氨基酸(aa)。2.权利要求1的肽，其具有少于55aa，少于50aa，少于45aa，少于40aa，少于35aa， 或少于30aa的长度。3.权利要求1或2的肽，其具有至少15aa，至少20aa或至少25aa的长度。4.权利要求1的肽，其中所述肽具有α-螺旋的二级结构。5.权利要求1的肽，其中在基序中存在的X4、X5>X8> X12> X15、X16> X18和X21位 置中每一个的氨基酸独立地选取，使得X4SA或E ； X5 SE或Q ； X8SK或A ； X12为 S或N ； X15为E、Q或A ； X16为L或M ； X18为K或Q ；而X21为I或V。6.权利要求1-4任一项所述的肽，其与SEQID NO: 1相比在对应于FoL残基D291 ； L294 ； E295 ； K297 ； L298 ； N299 ； Y301 ； D305 ； K306 ； Y308 ；或 V309 的位置处包 含至少一个氨基酸取代。7.权利要求5所述的肽，其与SEQID NO: 1相比在对应于FoL残基D291E ； L294A ； E295T, S ； K297R ； L298A ； N299D, E ； Y301W ； D305A ； K306R ； Y308E, D ；或V309I，N，Q处包含至少一个氨基酸取代。8.编码权利要求1-7任一项所述的肽的分离多核苷酸。9.一种核酸构建体，其包含权利要求8的多核苷酸，所述多核苷酸可操作连接于至少 一个控制序列，其在表达宿主中引导所述肽的产生。10.包含权利要求9的核酸构建体的重组表达载体。11.包含权利要求9的核酸构建体或权利要求10的重组表达载体的重组宿主细胞。12.—种制备权利要求1-7任一项所述的分离的肽的方法，包括下列步骤(a)在有益于所述肽产生的条件下培养包含所述核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构 建体包含编码所述肽至少一个拷贝的多核苷酸；和(b)回收所述肽。13.权利要求1-7任一项所述的肽在将所述肽结合于脂肪酶时抑制所述脂肪酶酶活性 的用途。14.包含权利要求1-7任一项所述的肽和脂肪酶的多肽，其中所述脂肪酶在平板测 定法中具有低于50PHLU/mg，低于45PHLU/mg，低于40PHLU/mg，低于35PHLU/mg，低于 30PHLU/mg，低于 25PHLU/mg，低于 20PHLU/mg，低于 15PHLU/mg，低于 lOPHLU/mg,低于5PHLU/mg或低于lPHLU/mg的磷脂酶活性，和/或不显示磷脂酶活性。15.权利要求14的包含脂肪酶的多肽，所述脂肪酶与细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus) (SEQ ID NO 9)具有至少 70%，至少 75%，至少 80%，至少 85%，至少 90%,至少95%，至少97%或100%的同一性。16.权利要求14-15任一项所述的多肽，其中所述脂肪酶包含至少一个改变，其独立 地为插入、缺失或取代。17.权利要求16的多肽，其中所述脂肪酶的至少一个改变包含对应于细毛嗜热霉 (SEQ ID NO 9)的残基 E87R、I90L、G91T、I202P、R209L、E210I 或 T244L 的一个或 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：伦纳多D玛利亚，李明，克里斯琴I乔尔根森，金博尔奇，汤姆AB尼尔森，杰斯珀文德，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK