用于在植物细胞中生产具有改变的糖基化模式的多肽的组合物和方法技术

本发明专利技术提供了改变植物或植物细胞中所关注的多肽的糖基化模式的方法。该方法包括在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中，表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区内，由此改变所述的植物或植物细胞中所关注的多肽的糖基化模式。

Composition and method for producing polypeptides with altered glycosylation patterns in plant cells

The present invention provides a method for changing the glycosylation patterns of polypeptides that are concerned in plant or plant cells. The method consists in transformed and separated zone at the subcellular expression of at least one glycosidase plant or plant cells, the expression of nucleic acid sequence encoding a polypeptide of interest, subcellular concern polypeptide of at least one of the glycosidases and the Co located in the plant or plant cells separation zone, glycosylation pattern of polypeptide concern changed the plants or plant cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在植物细胞中生产具有改变的糖基化模式的多肽的组合物和方法本专利技术的
和
技术介绍
在一些实施方案中，本专利技术涉及用于在植物细胞中生产具有改变的糖基化模式的多肽的组合物和方法。植物作为用于生产哺乳动物治疗蛋白质(包括酶)、生长因子、结构蛋白质(例如胶原蛋白)、嵌合蛋白质(例如Enbrel)和多聚体蛋白质(例如抗体)的宿主，具有很大的潜力。使用用于生产重组药物的植物的优点包括大规模生产、降低生产成本、保持和传递以及消除所得的包含可能的有害污染物(例如对人类和其他哺乳动物是致病性的病毒或朊病毒)的产物的风险。植物，类似于其他的异源表达系统(包括哺乳动物细胞、细菌、酵母菌和昆虫)，展现出糖基化的差异。在植物中，如同在其他的真核细胞中，在多聚核糖体(与内质网(ER)有关)上合成的大部分可溶性和膜结合的蛋白质为糖蛋白，包括后来被输送至高尔基复合体、溶酶体、细胞质膜或细胞外基质的那些蛋白质。附着在糖蛋白上的多糖包含大量以线性或支化结构连接的糖残基，其中所述的结构可以呈现许多不同的构造。这些多糖在促进正确的蛋白质折叠和组织、并由此增加蛋白质稳定性中起到基本的作用。它们还可以包含靶向信息，或者可以直接与蛋白质识别有关。3种主要的蛋白质翻译后修饰(与碳水化合物有关)为N-和O-连接的糖基化，以及糖基磷脂酰肌醇锚定物的插入。在进化过程中，哺乳动物和植物系统中的N-连接的糖基化机制是保守的。但是，在高尔基复合体中，在寡糖修整和多糖修饰的最终步骤中，观察到差异。与细菌(不具有N-连接的多糖)和酵母(具有聚甘露糖多糖)相反，植物生产具有复杂的N-连接的多糖的糖蛋白多聚体，其具有被2个N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基取代的核心。在哺乳动物中也观察到这些糖蛋白多聚体。例如参见KornfeldandKornfeld,Ann.Rev.Biochem.54:631(1985)。植物和动物糖多肽多聚体包含不同的末端碳水化合物，其与存在的寡糖的外部分支直接连接。动物糖多肽多聚体(包括哺乳动物糖多肽多聚体)具有作为末端碳水化合物残基存在的唾液酸，而植物糖多糖多聚体不具有该唾液酸。如同哺乳动物中发生的那样，末端核心被β1,2-连接的木糖(Xyl)和α1,3-连接的核心岩澡糖(Fuc)、而非α1,6-连接的核心岩澡糖取代。此外，植物糖蛋白缺乏在动物中发现的特征性含有半乳糖(Gal)-和唾液酸的复合N-多糖(N-乙酰基神经氨酸-α-2-6/3Galβ1-4)。植物衍生的重组蛋白质由于外来糖残基(即，α-1,3岩澡糖和β-1,2木糖残基)的存在，而具有严重的免疫原性的风险。为了降低免疫原性，已经研发了大量的平台技术，一些技术在NaokoYamane-OhnukiandMitsuoSatohMAbs.2009May-Jun；1(3):230-236,Strasseretal.,PlantBiotechnologyJournal(2008)6,pp.392-402；Matsuoetal.,JournalofBioscienceandBioengineering(2014)118,4,pp.448-454；MatsuoPlantBiotechnol.J.,9,264-281(2011),以及在US20030159178,US20120079627,20070089201和WO01/29242中有述。专利技术概述根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了在植物或植物细胞中改变所关注多肽的糖基化模式的方法，该方法包括在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中，表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于植物或植物细胞的亚细胞分隔区中，由此修改植物或植物细胞中所关注的多肽的糖基化模式。根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了生产所关注的多肽的方法，该方法包括：(a)在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中，表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于植物或植物细胞的亚细胞分隔区中；以及随后(b)分离所述的所关注的多肽。根据本专利技术的一些实施方案，经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞进一步包含与相同物种的植物或植物细胞相比，降低水平或活性的在至少一种糖基转移酶，其中所述的物种表达野生型水平或展现出野生型活性的至少一种糖基转移酶。根据本专利技术的一些实施方案，糖基转移酶包括β-(l-2)-木糖基转移酶和/或α-(1,3)-岩澡糖基转移酶。根据本专利技术的一些实施方案，经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞进一步包含编码融合多肽的核酸序列，其包含在翻译中与亲和部分融合的细胞壁结合肽，所述的亲和部分用于结合所关注的多肽。根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了分离的多肽，其包含在翻译中与异源亲和部分融合的细胞壁结合肽。根据本专利技术的一些实施方案，细胞壁结合肽为纤维素结合结构域(CBD)。根据本专利技术的一些实施方案，亲和部分用于结合抗体。根据本专利技术的一些实施方案，亲和部分用于结合酶生长因子或结构蛋白质。根据本专利技术的一些实施方案，用于结合抗体的亲和部分包含蛋白质A/G/L。根据本专利技术的一些实施方案，分离的多肽如SEQIDNO:10中所列。根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了分离的多核苷酸，其包含编码所述的多肽的核酸序列。根据本专利技术的一些实施方案，分离的多核苷酸如SEQIDNO:9中所列。根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了核酸构建体，其包含分离的多核苷酸以及用于指导多肽在植物细胞中表达的顺式作用调节元件。根据本专利技术的一些实施方案，核酸构建体包含编码至少一种糖苷酶的额外的核酸序列。根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了转基因植物或植物细胞，其包含本文所述的核酸构建体的多核苷酸。根据本专利技术的一些实施方案，转基因植物或植物细胞经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶。根据本专利技术的一些实施方案，植物细胞的转基因植物包含与相同物种的植物或植物细胞相比，降低水平或活性的在至少一种糖基转移酶，其中所述的物种表达野生型水平或展现出野生型活性的至少一种糖基转移酶。根据本专利技术的一些实施方案，糖基转移酶包括β-(l-2)-木糖基转移酶和/或α-(1,3)-岩澡糖基转移酶。根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了生产转基因植物或植物细胞的方法，该方法包括在植物或植物细胞中表达至少2种糖苷酶，使得至少2种糖苷酶共同定位于植物细胞或植物细胞的亚细胞分隔区内。根据本专利技术的一些实施方案，表达至少2种糖苷酶包括：(a)在第一植物的亚细胞分隔区内表达至少2种糖苷酶的第一糖苷酶；(b)在第二植物的亚细胞分隔区内表达至少2种糖苷酶的第二糖苷酶；以及(c)使第一植物和第二植物杂交。根据本专利技术的一些实施方案，表达至少2种糖苷酶包括：(i)向植物或植物细胞中引入核酸构建体，该构建体包含编码至少2种糖苷酶的核酸序列，其中至少2种糖苷酶的一种在翻译中与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合；或者(ii)向植物或植物细胞中引入核酸构建体系统，该系统包含：第一核酸构建体，其包含编码第一糖苷酶的核酸序列；第二核酸构建体，其包含编码第二糖苷酶的核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在植物或植物细胞中改变所关注的多肽的糖基化模式的方法，该方法包括在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于所述的植物或植物细胞的所述的亚细胞分隔区内，由此改变所述的植物或植物细胞中所述的所关注的多肽的糖基化模式。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.20 US 62/082,2041.一种在植物或植物细胞中改变所关注的多肽的糖基化模式的方法，该方法包括在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于所述的植物或植物细胞的所述的亚细胞分隔区内，由此改变所述的植物或植物细胞中所述的所关注的多肽的糖基化模式。2.一种生产所述的所关注的多肽的方法，该方法包括：(a)在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中，表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区中；以及随后(b)分离所述的所关注的多肽。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述的经转化而在所述的亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞与相同物种的植物或植物细胞相比，进一步包含降低水平或活性的至少一种糖基转移酶，其中所述的相同的物种表达野生水平的或者展现野生活性的所述的至少一种糖基转移酶。4.权利要求3所述的方法，其中所述的糖基转移酶包含β-(l-2)-木糖基转移酶和/或α-(1,3)-岩澡糖基转移酶。5.权利要求1-4的任意一项所述的方法，其中所述的经转化而在所述的亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞进一步包含编码融合多肽的核酸序列，所述的融合多肽包含细胞壁结合肽，其在翻译中与用于结合所述的所关注的多肽的亲和部分融合。6.一种分离的多肽，其包含在翻译中与异源亲和部分融合的细胞壁结合肽。7.权利要求5所述的方法或权利要求6所述的分离的多肽，其中所述的细胞壁结合肽为纤维素结合结构域(CBD)。8.权利要求5所述的方法或权利要求6-7的任意一项所述的分离的多肽，其中所述的亲和部分用于结合抗体。9.所述的方法或权利要求6-7的任意一项所述的分离的多肽，其中用于结合使得抗体的所述的亲和部分包含蛋白质A/G/L。10.权利要求9所述的在SEQIDNO:10中列出的分离的多肽。11.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求6-10的任意一项所述的多肽的核酸序列。12.权利要求11所述的在SEQIDNO:9中列出的分离的多肽。13.一种核酸构建体，其包含权利要求11-12的任意一项所述的分离的多核苷酸，以及用于指导所述的多肽在植物细胞中表达的顺式作用元件。14.权利要求13所述的核酸构建体，其包含编码至少一种糖苷酶的其他的核酸序列。15.一种转基因植物或植物细胞，其包含权利要求11-13的任意一项所述的核酸构建体的多核苷酸。16.权利要求15所述的转基因植物或植物细胞经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶。17.权利要求15-16的任意一项所述的转基因植物或植物细胞，其包含与相同物种的植物或植物细胞相比，降低水平或活性的至少一种糖基转移酶，其中所述的相同的物种表达野生水平的或者展现野生活性的所述的至少一种糖基转移酶。18.权利要求15-17的任意一项所述的转基因植物或植物细胞，其中所述的糖基转移酶包含β-(l-2)-木糖基转移酶和/或α-(1,3)-岩澡糖基转移酶。19.一种生产转基因植物或植物细胞的方法，该方法包括在所述的植物或植物细胞中表达至少2种糖苷酶，使得所述的至少2种糖苷酶共同定位于所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区内。20.权利要求19所述的方法，其中所述的表达至少2种糖苷酶包括：(a)在第一植物的所述的亚细胞分隔区内表达所述的至少2种糖苷酶的第一糖苷酶；(b)在第二植物的所述的亚细胞分隔区内表达所述的至少2种糖苷酶的第二糖苷酶；以及(c)使所述的第一植物和所述的第二植物杂交。21.权利要求19所述的方法，其中所述的表达至少2种糖苷酶包括：(i)向所述的植物或植物细胞中引入核酸构建体，该构建体包含编码所述的至少2种糖苷酶的核酸序列，其中所述的至少2种糖苷酶的一种在翻译中与用于在所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合；或者(ii)向所述的植物或植物细胞中引入核酸构建体系统，该系统包含：第一核酸构建体，其包含编码第一糖苷酶的核酸序列；第二核酸构建体，其包含编码第二糖苷酶的核酸序列，其中所述的第一糖苷酶和所述的第二糖苷酶的各种酶在所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区内在翻译中与用于共同定位的信号肽融合。22.一种生产转基因植物或植物细胞的方法，该方法包括在所述的植物或植物细胞中表达至少一种糖苷酶，以及所述的所关注的多肽的亲和部分，其中所述的亲和部分在翻译中与细胞壁结合肽融合。23.一种核酸构建体系统，其包含：(i)第一核酸构建体，其包含编码至少一种糖苷酶的核酸序列；(ii)第二核酸构建体，其包含编码所述的所关注的多肽的亲和部分的核酸序列，其中所述的亲和部分在翻译中与细胞壁结合肽融合。24.权利要求1或2所述的方法，其中所述的表达所述的核酸序列包括：(i)经转化而表达所述的至少一种糖苷酶的第一转基因植物；以及(ii)经转化而表达所述的所关注的多肽的第二转基因植物，其中所述的核酸序列编码所述的所关注的多肽。25.权利要求24所述的方法，其中所述的第一植物经转化而表达亲和部分，该亲和部分在翻译中与细胞壁结合肽融合，其中所述的亲和部分用于结合所述的所关注的多肽。26.一种包含编码至少2种糖苷酶的核酸序列的核酸构建体，其中所述的至少2种糖苷酶的每一种在翻译中与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。27.一种核酸构建体系统，其包含：(i)第一核酸构建体，其包含编码至少2种糖苷酶的第一糖苷酶的核酸序列；(ii)第二核酸构建体，其包含编码所述的至少2种糖苷酶的第二糖苷酶的核酸序列，其中所述的第一糖苷酶和所述的第二糖苷酶的每一种在翻译中与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。...

【专利技术属性】
技术研发人员：O·颂瑟雅夫，H·马格里颂，T·兹维林，A·雅里，
申请(专利权)人：耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发公司，
类型：发明
国别省市：以色列,IL