一种发酵生产普鲁兰的新方法技术

本发明专利技术涉及一种用发酵生产普鲁兰的新方法，其特点在于发酵过程中采用阶段或连续流加含有碳源和氮源的方法，碳源可用蔗糖或淀粉水解物，氮源为无机氮盐等，用本方法生产的普鲁兰发酵转化率一般可达到７０％以上，最高达７６％，平均分子量为１０万道尔顿。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，特别是在发酵生产普鲁兰的过程中，采用阶段式或连续式流加碳源的技术。早在1938年自出芽短梗霉的培养液中发现普鲁兰(pullulan)，一直到六十年代，人们才开始对其进行发酵、提取和应用等方面的研究，到七十年代由日本林原公司投入小批量生产，之后，其应用研究进入了高潮(S.Yuen,Process Biochem.,1974,November,p.7-9)。普鲁兰是由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)利用糖质化合物为基质进行好气发酵产生的胞外多糖，基本结构是由α-1,6-糖苷键连接的聚麦芽三糖，其分子量为几千到上百万。他无色、无味、无毒，在水中有极好的溶液性，有很好的粘接性能和成膜成纤维性能，制成的膜透气性很低，因此，在医药、食品、轻化工等许多领域有着广泛地应用前景。目前国际上用于普鲁兰生产的菌种均为出芽短梗霉，在以葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、菊糖、纤维素水解物为基质发酵时，多糖转化率均很低，以麦芽糖为基质发酵最高转化率为54％，虽然日本林原公司的加藤(kato)报导以淀粉水解物为基质发酵最高转化率为75％，但产物分子量仅有2万。通常发酵产物分子量高时，转化率均低，若获得较高转化率时，产物分子量低。而低分子量的产物，无论是粘接性、成膜性和成纤维性均差，其应用受到限制。本专利技术的目的在于即要有高的发酵转化率，同时也要提高产物的分子量，以获得更好的结果，达到提高其粘接性、成膜和成纤维性能，解决生产和应用问题。本专利技术的特点是利用筛选的一株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)在含有蔗糖或淀粉水解物的发酵培养基上进行流加发酵生产普鲁兰。发酵转化率在70％以上，所获得的普鲁兰平均分子量在10万道尔顿以上。本专利技术的技术方法是将出芽短梗霉接种在麦芽汁斜面培养基上，于28℃培养5天，然后接种到摇瓶培养基中，于28℃、旋转速度200转/分钟的摇床上培养作为种子，培养时间为24-48小时。采用流加发酵，发酵初始培养基为(％)蔗糖5.0-15，酵母膏0.1-1.0，玉米浆0.1-0.5，蛋白胨0.1-1.0，硫酸铵0.1-0.8，硫酸镁0.01，氯化钠0.1,pH3.0-8.0，也用DE值为20-60的淀粉水解物代替培养基中的蔗糖作为发酵培养基。发酵搅拌速度为200-900转/分钟，最适为300-700转/分钟，温度范围为25-32℃，最适为27-30℃，通气量为0.25-1.5(V/V)，最适为0.5-1.0(V/V)，罐压为0.015-0.1MPa，最适为0.02-0.07MPa。在发酵进行到30-100小时范围内可以补加碳源，在60-90小时时补加碳源效果最好。可以流加一定体积的含有10-60％的蔗糖或淀粉水解物和0.1-3.0％的氮源溶液，流加方式可采取连续式或阶段式，阶段式为每隔4-16小时流加一次，流加40-90小时，然后继续发酵40-80小时。发酵转化率一般在70％以上，产物平均分子量在10万道尔顿以上。实施例1(1)将出芽短梗霉菌种接种在麦芽汁斜面培养基上，于28℃培养5天。加入10毫升无菌水，制成细胞悬浮液。(2)取1.0毫升的种子悬浮液加到灭菌的装有80毫升的种子培养基的500毫升的三角瓶。摇瓶种子培养基组成为蔗糖5.0，酵母膏0.8，玉米浆0.2，蛋白胨0.3，硫酸铵0.5，硫酸镁0.01，氯化钠0.1,pH调到6.3，于0.1MPa灭菌30分钟。摇瓶种子于28℃，转速为200转/分钟的摇床上培养24-48小时。(3)在16升自控发酵罐内加入12升种子培养基，其组成为(％)蔗糖5.0，酵母膏0.5，蛋白胨0.05，硝酸铵0.6，硫酸镁0.01，调pH为6.3，在0.1MPa下灭菌30分钟后，冷却到28±1℃，按8.0％的接种量将摇瓶种子接入发酵罐。于28±1℃，通气量0.5V/V，罐压0.05MPa，搅拌速度700转/分条件下发酵36小时。(4)在500升自控发酵罐内加入250升发酵培养基，其组成为(％)蔗糖8.0，酵母膏0.4，蛋白胨0.1，硫酸铵0.5，硫酸镁0.01，氯化纳0.1，pH调到6.2，在压力为0.1MPa下灭菌30分钟，冷却到28±1℃时，按7.5％接种量将种子罐内培养好的种子接入，在28℃下发酵，通气量为0.75V/V，罐压0.045MPa，搅拌速度400转/分钟，发酵到72小时，开始每隔12小时流加灭菌的含有30％蔗糖和3.0％硫酸铵的混合液14.5升，共流加4次，发酵到156小时结束。转化率为76.2％，产物平均分子量为10万道尔顿。实施例2(1)将出芽短梗霉菌种接种在麦芽汁斜面培养基上，于28℃培养5天。加入10毫升无菌水，制成细胞悬浮液。(2)取1.0毫升的种子悬浮液加到灭菌的装有80毫升的种子培养基的500毫升的三角瓶。摇瓶种子培养基组成为蔗糖5.0，酵母膏0.8，玉米浆0.2，蛋白胨0.3，硫酸铵0.5，硫酸镁0.01，氯化钠0.1，pH调到6.3，于0.1MPa灭菌30分钟。摇瓶种子于28℃，转速为200转/分钟的摇床上培养24-48小时。(3)在16升自控发酵罐内加入12升种子培养基，其组成为(％)蔗糖5.0，酵母膏0.5，蛋白胨0.05，硝酸钠0.6，硫酸镁0.01，调pH为6.3，在0.1MPa下灭菌30分钟后，冷却到28±1℃，按10.0％的接种量将摇瓶种子接入发酵罐。于28±1℃，通气量0.5V/V，罐压0.05MPa，搅拌速度700转/分条件下发酵36小时。(4)在500升自控发酵罐内加入250升发酵培养基，其组成为(％)DE值为40-60的淀粉水解物7.0，酵母膏0.3，蛋白胨0.1，硫酸铵0.7，硫酸镁0.01，氯化钠0.1，调pH6.0，于0.1MPa压力下灭菌30分钟，冷却到28±1℃时，按接种量10％接入发酵罐，于28℃，通气量1.0V/V，罐压0.3MPa，搅拌速度450转/分钟的条件下发酵，到60小时开始每隔12小时流加15.3升的含有30％的DE值为40的淀粉水解物和0.3％的硫酸铵溶液，到发酵120小时加完，继续发酵到156小时结束。转化率为72.1％，产物平均分子量为12万道尔顿。实施例3(1)将出芽短梗霉菌种接种在麦芽汁斜面培养基上，于28℃培养5天。加入10毫升无菌水，制成细胞悬浮液。(2)取1.0毫升的种子悬浮液加到灭菌的装有80毫升的种子培养基的500毫升的三角瓶。摇瓶种子培养基组成为蔗糖5.0，酵母膏0.8，玉米浆0.2，蛋白胨0.3，硫酸铵0.5，硫酸镁0.01，氯化钠0.1,pH调到6.3，于0.1MPa灭菌30分钟。摇瓶种子于28℃，转速为200转/分钟的摇床上培养24-48小时。(3)在16升自控发酵罐内加入10升种子培养基，其组成为(％)蔗糖5.0，酵母膏0.5，蛋白胨0.05，硝酸铵0.6，硫酸镁0.01，调pH为6.3，在0.1Mpa下灭菌30分钟后，冷却到28±1℃，按5.0％的接种量将摇瓶种子接入发酵罐。于28±1℃，通气量0.5V/V，罐压0.05MPa，搅拌速度700转/分条件下发酵48小时。(4)在500升自控发酵罐内加入250升发酵培养基，其组成为(％)蔗糖8.0，酵母膏0.4，蛋白胨0.1，硝酸铵0.5，硫酸镁0.01，氯化纳0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵生产普鲁兰的新方法，其特征在于：发酵生产普鲁兰所使用的发酵培养基为（％）：蔗糖５．０－１５，酵母膏０．１－１．０，玉米浆０．１－０．５，蛋白胨０．１－１．０，硫酸铵０．１－０．８，硫酸镁０．０１，氯化钠０．１，ｐＨ３．０－８．０，也可以用ＤＥ值为２０－６０的淀粉水解物代替培养基中的蔗糖作为发酵培养基。发酵过程中，需要阶段流加碳源或采用连续流加碳源，流加的碳源中含有氮源。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙万儒，江宁，任永娥，徐纯锡，周铁锁，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]