本发明专利技术提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤：a)在发酵培养基中培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列；或提供革兰氏阴性宿主细胞，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列并且其中所述革兰氏阴性宿主细胞包括在周质中表达的细菌类毒素；a(i))诱导所述细菌类毒素的表达；b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括：I)使宿主细胞接受pH休克；II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或III)使宿主细胞接受低于-20℃的温度；和c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】背景 本专利技术涉及用于产生重组蛋白的方法，具体是包括培养表达重组蛋白的宿主细胞和使宿主细胞成熟的步骤的用于产生重组蛋白的方法。本专利技术还提供了通过本专利技术的方法可获得的重组蛋白，和包括所述重组蛋白的免疫原性组合物或疫苗。某些毒素的表达已知是有挑战性的，例如白喉毒素。DT可以通过纯化来自白喉杆菌{Corynebacterium diphtheriae)的培养物的毒素，随后通过化学解毒产生,或者可以通过纯化毒素的重组或遗传解毒的类似物制成(例如CRM197，或US4，709, 107、US5.846.711、US5, 601，827和US5, 917，017中描述的其它突变体)。由于低蛋白丰度，用于疫苗中的白喉毒素例如CRM197的大量的产生已被阻碍。此问题先前已通过在大肠杆菌中表达CRM197 (Bishai等J.Bacteriol.169:5140-5151)得以解决，Bishai等描述了包含白喉毒素(包括tox信号序列)的重组融合蛋白的表达，这导致降解的蛋白的产生。包含tox信号序列的白喉片段的克隆和这些序列在大肠杆菌中的表达涉及某些困难。表达的蛋白分泌到周质间隙并且此分泌伴随宿主细胞的活力降低(O’Keefe等Proc.Natl, Acad.Sc1.86:343-346)和重组蛋白的蛋白水解增加(Bishai等JBacteriol.169:5140-5151)。由于这些原因，已经暗示去除tox信号序列使得表达不再是在周质，这可以增加白喉类毒素的表达(Bishai等)。PCT/EP2010/065047 (W0 2011/042516)首次公开了成功的 CRM197 的周质表达。这增加了 CRM197的产量，但是即使如此，仍然可以进行对提取方法的改善以增加产量。Rathore公开了渗透压程序的优化,用于在大肠杆菌中表达的蛋白产物的分离(Rathore等Biotechnol.Prog.2003, 19, 15`41-1546)。Bochner 等还公开了用于从宿主细胞回收周质蛋白的方法(US4680262)。从而本专利技术提供了改善的用于产生重组多肽的方法，其包括使宿主细胞成熟的步骤，其中此步骤可以包括下列的任一或更多: (1)使宿主细胞接受pH休克； (2)孵育宿主细胞；或 (3)冷冻宿主细胞。此使宿主细胞成熟的步骤具有实质上增加蛋白提取效率的令人惊讶的结果。简要概述 在第一实施方案，提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤: a)在发酵培养基中培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列。a(i))诱导所述细菌类毒素的表达； b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括: I)使宿主细胞接受PH休克； II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或III)使宿主细胞接受低于-20°C的温度；和 c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。在第二实施方案，提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤: a)提供包括在周质中表达的细菌类毒素的革兰氏阴性宿主细胞； b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括: I)使宿主细胞接受PH休克； II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或 III)使宿主细胞接受低于_20°C的温度；和 c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。在第三实施方案中，提供了通过本专利技术方法可获得或通过本专利技术方法获得的细菌类毒素。在第四实施方案，提供包括本专利技术细菌类毒素和药学可接受赋形剂的免疫原性组合物。在第五实施方案，提供包括本专利技术免疫原性组合物的疫苗。在第六实施方案，提供本专利技术的免疫原性组合物或疫苗在用于疾病的预防或治疗的药物的制造中的用途。在第七实施方案，提供了预防或治疗疾病的方法，包括向患者施用本专利技术的免疫原性组合物或疫苗。附图简述 图1-发酵概况的描述，在20升规模补料发酵期间监测发酵参数。线I描述添加的基质的量(克)，线2描述pH，线3描述搅拌速率(rpm)，线4描述p02 (%)，线5描述温度(V )并且线6描述添加的碱的量(克)。图2-对于在pH6.8下进行的生长，作为补料速率和诱导期间pH的函数的CRM197在周质中的产生和细胞缔合级分的描述。左边小图显示周质CRM197的产生。右边小图显示细胞缔合的CRM197的产生。图3-发酵概况的描述，在20升规模补料分批发酵和成熟期间监测方法参数。线I描述添加的基质的量(克)，线2描述pH，线3描述搅拌速率(rpm)，线4描述p02 (%)，线5描述温度(V )并且线6描述添加的碱的量(克)。箭头指示成熟步骤的开始。成熟步骤在右边小图中放大。图4-本专利技术多核苷酸和多肽的序列表。专利技术详述 本专利技术提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤: a)在发酵培养基中培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列。a(i))诱导所述细菌类毒素的表达； b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括: I)使宿主细胞接受PH休克； II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或 III)使宿主细胞接受 低于_20°C的温度；和c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。在进一步的实施方案中，提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤: a)提供包括在周质中表达的细菌类毒素的革兰氏阴性宿主细胞； b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括: I)使宿主细胞接受PH休克； II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或 III)使宿主细胞接受低于_20°C的温度；和 c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。周质是革兰氏阴性细菌中细胞质膜和外膜之间的间隙。术语“周质表达”指在宿主细胞内蛋白(例如细菌类毒素)的表达/产生和其分泌进入宿主细胞的周质间隙。周质表达适合通过使用信号序列实现，所述信号序列能引导表达的蛋白到周质。当在革兰氏阴性细菌中与周质信号序列一起表达时，典型地，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%的目的多肽导向周质。“重组”核酸是一种具有非天然发生的序列或具有通过人工组合两种另外分开的序列区段制成的序列的核酸。人工组合可以是通过化学合成，或更常规地，通过分离的核酸区段的人工操作，例如通过遗传改造技术实现。“重组”蛋白是一种由异源(例如，重组)核酸编码的蛋白，所述核酸已被导入宿主细胞，例如细菌或真核细胞。所述核酸可以被导入到具有能够表达由所述导入的核酸编码的蛋白的信号的表`达载体上，或所述核酸可以被整合进宿主细胞染色体。术语“使宿主细胞成熟”指一种方法，其在步骤c)之前进行，并且增加重组多肽例如细菌类毒素从宿主细胞或周质释放的效率。重组多肽从周质释放的效率可以以多种方法确定。例如通过测量在渗透压休克后从周质释放的重组多肽的量，和在渗透压休克后仍保持与细胞缔合的重组多肽的量，这可以用于计算所产生的目的多肽的总量(细胞质和周质)。在渗透压休克后保持细胞缔合的多肽的量可以通过使用弗氏压碎器破碎细胞后测量蛋白水平来确定。为了计算重本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于细菌类毒素的周质表达的方法，其包括步骤：a)?在发酵培养基中培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列；a(i))诱导所述细菌类毒素的表达；b)?使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括：I)?使宿主细胞接受pH休克；II)?无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或III)?使宿主细胞接受低于?20℃的温度；和c)?从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.13 GB 1106225.4;2011.04.13 US 61/4748151.用于细菌类毒素的周质表达的方法，其包括步骤: a)在发酵培养基中培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列； a(i))诱导所述细菌类毒素的表达； b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括: I)使宿主细胞接受PH休克； II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或 III)使宿主细胞接受低于_20°C的温度；和 c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。2.用于细菌类毒素的周质表达的方法，其包括步骤: a)提供革兰氏阴性宿主细胞，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列并且其中所述革兰氏阴性宿主细胞包括在周质中表达的细菌类毒素； b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括: I)使宿主细胞接受PH休克； II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或 III)使宿主细胞接受低于_20°C的温度；和 c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。3.权利要求1或2的方法，其中所述pH休克包括使发酵培养基的pH升高或降低多于0.2个pH单位或多于0.5个pH单位或0.1-2.0个pH单位或0.2-1.0个pH单位。4.前述权利要求任一项的方法，其中所述孵育步骤包括孵育宿主细胞10分钟-1年、10分钟-6个月、10分钟-12小时、10分钟-6小时或10分钟-2小时，任选地在20°C -40°C的温度，例如23°C左右的温度下。5.前述权利要求任一项的方法，其中步骤b)包括使宿主细胞接受低于-20 V、-40 V、-60 V、-70 V或-80 V的温度至少I小时、2小时、5小时、12小时、24小时、I天、2天或5天。6.前述权利要求任一项的方法，其中步骤b)包括通过冷冻并然后融化宿主细胞的步骤。7.前述权利要求任一项的方法，其中步骤b)包括: -使宿主细胞接受PH休克，随后在无补料添加的条件下孵育宿主细胞； -在无补料添加的条件下孵育宿主细胞，随后使宿主细胞接受PH休克； -在无补料添加的条件下孵育宿主细胞，随后使宿主细胞接受低于_20°C的温度； -使宿主细胞接受PH休克，随后使宿主细胞接受低于-20°C的温度； -使宿主细胞接受PH休克，随后在无补料添加的条件下孵育宿主细胞，随后使宿主...
【专利技术属性】
技术研发人员：PMH德霍泰，P戈芬，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。