发酵方法技术

本发明专利技术涉及用于发酵博德特氏菌的方法，其包括a)提供博德特氏菌属物种细菌的样品；b)在第一环境中在至少一种bvg(博德特氏菌毒力基因)调节条件下将所述博德特氏菌属物种细菌的样品孵育至少5代，从而产生成熟培养物；c)在第二环境中在至少一种bvg调节条件不存在的情况下孵育所述成熟培养物；其中步骤c)在步骤b)之后发生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】 背景 细菌百日咳博德特氏菌/76?τ--5·5·Υ5·)是百日咳（在婴儿和年幼儿童中可 严重的呼吸系统疾病）的致病因子。该疾病病程的特征在于快速咳嗽的发作，和随后的吸 气努力，经常与特征性的喘息声音相关。在严重的情况下，缺氧可导致脑损伤；然而，最 常见的并发症是继发性肺炎。 百日咳通常认为由百日咳博德特氏菌引起，但偶尔副百日咳博德特氏菌（汉 从具有百日咳的典型体征和症状的患者分离到。副百日咳博德特氏菌 感染比百日咳博德特氏菌的频率更低，其中5-10%的百日咳与副百日咳博德特氏菌相关 (Mertsola (1985) Eur J Clin Microbiol 4; 123; Lautrop (1971) Lancet 1(7711) 1195-1198)。副百日咳博德特氏菌与轻度的临床症状相关，其组合它与百日咳博德特氏菌 的血清学交叉反应性，使得副百日咳博德特氏菌难以诊断。 针对百日咳博德特氏菌的第一代疫苗是全细胞疫苗，由杀灭的全细菌构成。这些 在20世纪50年代和60年代在许多国家被引入，并且成功降低百日咳的发病率。用全细胞 百日咳博德特氏菌疫苗的问题在于与它们相关的高水平的反应原性。含有纯化的百日咳博 德特氏菌蛋白的无细胞疫苗反应原性较低，并且已经被用于许多国家的接种疫苗计划。通 常含有百日咳毒素（PT)、丝状血细胞凝集素（FHA)和相当经常的百日咳杆菌粘附素（PRN) 的无细胞疫苗被广泛使用并提供有效保护免于百日咳的严重性。 概述 介绍 在第一个方面，提供了，其包括以下步骤： a) 提供博德特氏菌属物种细菌的样品； b) 在第一环境中在至少一种bvg (博德特氏菌毒力基因）调节条件下将所述博德特氏 菌属物种细菌的样品孵育至少5代，从而产生成熟培养物； c) 在第二环境中在至少一种bvg调节条件不存在的情况下孵育所述成熟培养物； 其中步骤c)在步骤b)之后发生。 在第二个方面，提供了，其包括以下步骤： a) 在包含至少一种bvg调节剂的第一培养基中提供博德特氏菌属物种细菌的样品； b) 在包含至少一种bvg调节剂的第一培养基中将所述样品孵育至少5代，从而产生成 熟培养物； C)在第二培养基中在至少一种bvg调节剂不存在的情况下孵育所述成熟培养物； 其中步骤C)在步骤b)之后发生。 在第三个方面，提供了，其包括以下步骤： a) 在第一培养基中提供博德特氏菌属物种细菌的样品； b) 在包含至少一种bvg调节剂的第一培养基中将所述样品孵育至少5代，从而产生成 熟培养物； C)在第二培养基中在至少一种bvg调节剂不存在的情况下孵育所述成熟培养物； 其中步骤C)在步骤b)之后发生。 在第四个方面，提供了通过所述方法可获得的毒力因子。 在第五个方面，提供了通过所述方法获得的毒力因子。 在第六个方面，提供了包含毒力因子和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合 物。 在第七个方面，提供了包含免疫原性组合物的疫苗。 在第八个方面，提供了免疫原性组合物或疫苗在预防或治疗疾病中的用途。 在第九个方面，提供了免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗或预防细菌性疾病 的药物中的用途。 在第十个方面，提供了预防或治疗疾病的方法，其包括向患者施用免疫原性组合 物或疫苗。 附图简述 图1.描绘bvf基因型和bvg+基因型百日咳博德特氏菌细胞针对发酵时间的生长的 图。bvf细胞的生长通过连接菱形点的线描绘；bvg+细胞的生长通过连接正方形点的线描 绘。 图2.描绘在不同水平的bvg调节剂烟酸存在的情况下作为bvf基因型的百日 咳博德特氏菌细胞针对代数的比例的图。当使用〇. 〇〇4g/L烟酸时，连接正方形点的线描绘 bvg_细胞的比例，当使用0. 021g/L烟酸时，连接圆形点的线描绘bvg^基因型细胞的比例， 当使用〇. 113g/L烟酸时,连接菱形点的线描绘bvg^细胞的比例，当使用0. 604g/L烟酸时， 连接三角形点的线描绘bvg^细胞的比例。 图3描绘对于实施例6中描述的两次发酵的溶解氧概况的图。顶部线描绘当发酵 是氧充足时的溶解氧概况，且底部线描绘当发酵是氧受限时的溶解氧概况。 图4描绘在0. 004g/L烟酸存在的情况下发酵的4次培养物中bvg-基因型细胞针 对代数的比例的图。正方形点代表发酵开始时具有95% bvg-基因型细胞的起始比例的培 养物。圆形点代表发酵开始时具有75% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。三角形点 代表发酵开始时具有25% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。菱形点代表发酵开始时 具有5% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。 图5描绘在0.6g/L烟酸存在的情况下发酵的4次培养物中bvg-基因型细胞针对 代数的比例的图。正方形点代表发酵开始时具有95% bvg-基因型细胞的起始比例的培养 物。圆形点代表发酵开始时具有75% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。三角形点代 表发酵开始时具有25% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。菱形点代表发酵开始时具 有5% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。 详述 总体 本专利技术人已经令人惊讶地发现，百日咳毒力因子的更高产量可以通过在至少一种bvg 调节条件存在的情况下培养本文所述的百日咳物种来获得，尽管bvg调节条件通常被认为 抑制百日咳物种的毒力因子的表达。 百日咳博德特氏菌可以在毒力方面显示不同的表型。这些表型被命名为Bvg+和 Bvg- (Bvg表明博德特氏菌毒力基因的表达或其缺乏）。Bvg+表型是特征在于毒力因子诸 如百日咳毒素（PT)、丝状血细胞凝集素（FHA)和百日咳杆菌粘附素（PRN)，而且还有其它毒 素和粘附素的高表达的毒力表型。Bvg-表型是不表达毒力因子诸如PT或其它毒素/粘附 素的无毒表型。 表型状态之间的转换是在双组分调控系统BvgAS的控制之下，其直接或间接检测 环境条件，诸如温度、硫酸盐、烟酸，并调节在其控制下的基因表达。在某些条件下，传感蛋 白BvgS自磷酸化，并且经由磷酸化级联，磷酰基最终被转移到应答调节因子BvgA。活性 BvgA~P(磷酸化的）结合毒力因子基因的启动子区域，并调节其转录水平。此类调节系统在 一种单一中央转录调节因子BvgAS的水平上导致环境信号（environmental cues)的整合。 作为输出，百日咳博德特氏菌响应于环境条件在转录水平调节毒力因子的表达。 基因在BvgAS系统的转录控制下形成Bvg调节子。 抑制百日咳菌产生毒力因子的化合物经常通过调节bvg遗传基因座发挥作用，因 此可以被命名为bvg调节剂。类似地，有利于Bvg+表型的条件可以被命名为bvg调节条件。 通常，博德特氏菌细胞能够在Bvg+和Bvg-基因型之间突变。具体而言，在培养过 程中，博德特氏菌细胞可以经由自发突变突变为Bvg-基因型。Bvg-基因型细胞具有Bvg-表 型，这意味着它们产生较少量的毒力因子（并且因此在旨在产生高水平毒力因子的发酵方 法中是不希望的）。Bvg-基因型细胞产生较低水平的毒力因子这一事实相比于Bvg+基因 型细胞为Bvg-基因型细胞提供了优势，即在产生毒力因子中消耗其能量较少，使它们生长 更快。出于这个原因，当培养博德特氏菌细胞时，具有Bvg-基因型的细胞比例趋向于随着 时间增加本文档来自技高网...

【技术保护点】
发酵方法，其包括以下步骤：a) 提供博德特氏菌属物种细菌的样品；b) 在第一环境中在至少一种bvg(博德特氏菌毒力基因)调节条件下将所述博德特氏菌属物种细菌的样品孵育至少5代，从而产生成熟培养物；c) 在第二环境中在至少一种bvg调节条件不存在的情况下孵育所述成熟培养物；其中步骤c)在步骤b)之后发生。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.01 US 61/5935411. 发酵方法，其包括以下步骤： a) 提供博德特氏菌属物种细菌的样品； b) 在第一环境中在至少一种bvg(博德特氏菌毒力基因）调节条件下将所述博德特氏 菌属物种细菌的样品孵育至少5代，从而产生成熟培养物； c) 在第二环境中在至少一种bvg调节条件不存在的情况下孵育所述成熟培养物； 其中步骤c)在步骤b)之后发生。2. 权利要求1的发酵方法，其中所述bvg调节条件包括在以下温度下孵育所述样品 (i) 低于或等于28°C、低于或等于27°C、低于或等于26°C、或低于或等于25°C ; (ii) 高于或等于18°C、高于或等于20°C、高于或等于22°C、或高于或等于24°C ;或 (iii) 0°C至 28°C、0°C至 27°C、0°C至 26°C或 0°C至 25°C。3. 权利要求1-2中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节条件包括在以下氧浓度下孵 育所述样品 (i) 低于或等于〇. 100、低于或等于〇. 090、低于或等于0. 080、或低于或等于0. 070 mmol溶解02 /升； (ii) 闻于或等于0. 001、闻于或等于0. 050、闻于或等于0. 010、闻于或等于0. 015、闻 于或等于〇. 020、或高于或等于0. 025 mmol溶解02 /升；或 (iii) 0· 010 至 0· 100、0· 010 至 0· 090、0· 010 至 0· 080 或 0· 010 至 0· 070 mmol 溶解 02 /升。4. 权利要求1-3中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节条件包括在碱性pH孵育所述 样品。5. 权利要求4的发酵方法，其中所述碱性pH是以下pH (i) 大于或等于7. 2、大于或等于7. 3、大于或等于7. 4; (ii) 小于或等于9. 5、小于或等于9. 0、小于或等于8. 5或小于或等于8. 0 ;或 (iii) 7. 2 至 8. 0、7· 3 至 8.0 或 7. 4 至 8.0。6. 权利要求1-5中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节条件包括在酸性pH孵育所述 样品。7. 权利要求6的发酵方法，其中所述酸性pH是以下pH (i) 小于或等于7. 0、小于或等于6. 8、小于或等于6. 6、小于或等于6. 4或小于或等于 6. 2 ； (ii) 高于或等于4. 5、高于或等于5. 0、高于或等于5. 5、高于或等于6. 0或高于或等于 6. 5 ;或 (iii) 5.0 至 7. 0、5.0 至 6. 9 或 5.0 至 6. 8。8. 任何前述权利要求的发酵方法，其中所述第一环境是第一培养基。9. 任何前述权利要求的发酵方法，其中所述第二环境是第二培养基。10. 权利要求8的发酵方法，其中所述至少一种bvg调节条件包括在所述第一培养基中 的至少一种bvg调节剂的存在。11. 发酵方法，其包括以下步骤： a) 在包含至少一种bvg调节剂的第一培养基中提供博德特氏菌属物种细菌的样品； b) 在所述包含至少一种bvg调节剂的第一培养基中将所述样品孵育至少5代，从而产 生成熟培养物； C)在第二培养基中在至少一种bvg调节剂不存在的情况下孵育所述成熟培养物； 其中步骤C)在步骤b)之后发生。12. 发酵方法，其包括以下步骤： a) 在第一培养基中提供博德特氏菌属物种细菌的样品； b) 在包含至少一种bvg调节剂的第一培养基中将所述样品孵育至少5代，从而产生成 熟培养物； C)在第二培养基中在至少一种bvg调节剂不存在的情况下孵育所述成熟培养物； 其中步骤C)在步骤b)之后发生。13. 前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述博德特氏菌属物种是选自百日咳博 德特氏菌副百日咳博德特氏菌（/ferofeieBa 和 支气管炎博德特氏菌（及的物种。14. 前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述发酵方法是用于从博德特氏菌属物 种生产一种或多种毒素的方法。15. 前述权利要求中任一项的发酵方法，其中步骤b)包括小于40、小于35、小于30、小 于25、小于20或小于18代。16. 前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述方法是用于在工业培养物中保存 bvg+基因型的博德特氏菌属物种的方法。17. 前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述方法是用于在工业培养物中在生长 中将毒力因子的表达损失降到最低的方法。18. 前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述方法是用于增强产生博德特氏菌属 物种毒力因子的方法。19. 权利要求10-18中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含烟酸。20. 权利要求19的发酵方法，其中所述烟酸是以以下的浓度 (i) 大于或等于〇. 〇〇4g/l、大于或等于0. 01g/l、大于或等于0. lg/Ι、大于或等于 0. 2g/l、大于或等于0. 3g/l、或大于或等于0. 004g/l ; (ii) 小于或等于400g/l、小于或等于300 g/1、小于或等于200g/l、小于或等于100g/ 1、 小于或等于50g/l、或小于或等于5g/l ;或 (iii) 0· 004g/l至 500g/l、0. 01g/l至 400g/l、0. lg/Ι至 300g/l、0. 4g/l至 200g/l或 0·2g/l 至 100g/l。21. 权利要求10-20中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含选自镁盐、硫酸盐、 磷酸盐和碳酸盐的无机盐。22. 权利要求21的发酵方法，其中所述无机盐是硫酸盐。23. 权利要求22的发酵方法，其中所述硫酸盐是以以下的浓度 (i) 大于或等于〇. 〇4mM、大于或等于0. 08mM、大于或等于ImM、大于或等于4mM、大于或 等于8mM或大于或等于10mM ; (ii) 小于或等于50mM、小于或等于40mM、小于或等于35mM、小于或等于30mM、小于或 等于25mM、小于或等于20mM或小于或等于15mM ;或 (iii) 0. 04mM 至 40mM、0. 08mM 至 至 40mM、8mM 至 10mM、15mM 至 40mM、或 17mM 至 40mM。24. 权利要求21的发酵方法，其中所述无机盐是磷酸盐。25. 权利要求24的发酵方法，其中所述磷酸盐是以以下的浓度 (i) 大于或等于〇. 4g/l、大于或等于0. 5g/l、大于或等于0. 6g/l、或大于或等于0. 7g/ L ； (ii) 小于或等于20g/l、小于或等于18g/l、小于或等于16g/l、小于或等于10g/l、小 于或等于5g/l、或小于或等于2g/l ;或 (iii) 0· 4g/L 至 20g/L、0. 5g/L 至 20g/L、0. 6g/L 至 20g/L 或 0· 7g/L 至 20g/L。26. 权利要求10-25中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含蔗糖。27. 权利要求26的发酵方法，其中所述蔗糖是以以下的浓度 (i) 大于或等于10mM、大于或等于15mM、大于或等于20mM、大于或等于25mM、大于或等 于30mM、大于或等于35mM或大于或等于40mM ; (ii) 小于或等于l〇〇mM、小于或等于90mM、小于或等于85mM、小于或等于80mM、小于或 等于75mM、小于或等于70mM或小于或等于50mM ;或 (iii) 10mM 至 lOOmM、15mM 至 95mM、20mM 至 90mM、25mM 至 85mM 或 30mM 至 80mM。28. 权利要求10-27中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含选自酵母提取物、 胰蛋白酶大豆琼脂、磷酸胰蛋白际、脑心组织浸出物和蛋白胨的复合培养基组分。29. 权利要求28的发酵方法，其中所述复合培养基组分是以以下的浓度 (i) 大于或等于lg/L、大于或等于3g/L、大于或等于5g/L、或大于或等于10g/L ; (ii) 小于或等于40g/L、小于或等于35g/L、小于或等于30g/l、小于或等于25g/l、或 小于或等于20g/L;或 (iii) lg/L 至 40g/l、3g/l 至 40g/l、5g/l 至 40g/L、或 10g/L 至 40g/L。30. 权利要求10-29中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含脯氨酸。31. 权利要求30的发酵方法，其中所述脯氨酸是以以下的浓度 (i) 大于或等于〇. 25g/l、大于或等于0. 4g/l、大于或等于0. 5g/l、大于或等于0. 6g/ L、大于或等于lg/L、大于或等于2g/L、大于或等于3g/L、或大于或等于4g/l ; (ii) 小于或等于50g/L、小于或等于30g/L、小于或等于25g/L、小于或等于20g/L、或小 于或等于15g/L ;或 (iii) 0· 25g/L 至 50g/L、0. 4g/L 至 50g/L、0. 5g/L 至 50g/L、0. 6g/L 至 50g/L、lg/L 至 50g/L、2g/L 至 50g/L、3g/L 至 50g/L、或 4g/L 至 50g/L。32. 权利要求10-31中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含以以下浓度的钠离子 (i) 大于l〇〇mM、大于120mM、大于150mM、大于175mM、大于200mM、或大于250mM ; (ii) 小于2000mM、小于lOOOmM、或小于800mM ;或 (iii) lOOmM 至 2000mM、120mM 至 2000mM、150mM 至 2000mM、175mM 至 2000mM、或 200mM 至 2000mM。33. 权利要求10-32中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含消泡剂。34. 权利要求33的发酵方法，其中所述消泡剂是聚二甲基硅氧烷。35. 权利要求33或3...

【专利技术属性】
技术研发人员：PMH德霍泰，P戈芬，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE