制备L-精氨酸的方法技术

通过在培养基中培养具有生产Ｌ－精氨酸能力的微生物制备Ｌ－精氨酸，所述微生物经过修饰，使ｌｙｓＥ基因的表达增强，该微生物还可进一步修饰，使精氨酸阻遏物不能发挥正常功能，或者该微生物经过进一步修饰，使Ｌ－精氨酸生物合成途径的酶细胞内活性增强，这样，在培养基中可以生产、积累Ｌ－精氨酸，并可从培养基中收获Ｌ－精氨酸。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有生产L-精氨酸能力的微生物，以及应用这种微生物制备L-精氨酸的方法。L-精氨酸是一种具有工业用途的氨基酸，可以作为肝功能促进剂、氨基酸输注液以及复合氨基酸药物等的成分。
技术介绍
通过发酵进行L-精氨酸制备的传统方法通常应用野生型棒状细菌菌株；耐某些试剂包括磺胺类药物，2-噻唑丙氨酸，α -氨基-β -羟基戊酸等的棒状细菌；除了耐2-噻唑丙氨酸外，还是L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸营养缺陷型的棒状细菌(日本专利公开(Kokai)号Μ-44096)；耐酮丙二酸、氟丙二酸或单氟乙酸的棒状细菌(日本专利公开号57-18989)；耐精氨醇(argininol)的棒状细菌(日本专利公开号62-24075)；耐X-胍的棒状细菌(X代表脂肪酸或脂肪链衍生物，日本专利公开号 2-186995)等。另一方面，业已公开了多种应用重组DNA技术、通过增强L-精氨酸生物合成酶活性的方法增加L-精氨酸产量的技术。例如，业已公开了通过应用微生物制备L-精氨酸的方法，所述微生物属于拥有重组DNA的棒状杆菌或短杆菌属，所述重组DNA包括载体DNA和含有乙酰鸟氨酸脱乙酰酶、N-乙酰谷氨酸-Y -半醛脱氢酶、N-乙酰谷氨酸激酶 (glutamokinase)和精氨琥珀酸裂解酶的DNA片段，所述DNA片段源于属于埃希氏菌属的微生物(日本专利公告(Kokoku)号5-23750)，所述微生物如具有谷氨酸脱氢酶活性增强的棒状细菌(EP 1057 893A1)、引入了 N-乙酰谷氨酸合成酶基因(argA)的大肠杆菌(参考日本专利公开号57-5693)等。而且，对于棒状细菌业已表明，L-精氨酸生物合成途径中一些酶的生成受到L-精氨酸的抑制。而且，有报道指出，虽然L-精氨酸生物合成途径中的一些酶会受到L-精氨酸的抑制，但是L-精氨酸对这些酶的抑制作用在一些棒状细菌突变株中不敏感，并显示L-精氨酸积累量的增加(Agric. Biol. Chem.，43 (1)，105，1979)。而且，对于大肠杆菌来说，业已鉴定了 L-精氨酸生物合成途径的阻遏物和编码该阻遏物的基因(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1987)，84(19)，6697-701)，并对阻遏物蛋白与多种L-精氨酸生物合成途径基因的相互作用进行了研究(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1987)，84 (19) ,6697-701，J. Mol. Biol. (1992)，226，367-386)。但是，在棒状细菌中尚未鉴定L-精氨酸生物合成途径的阻遏物蛋白。尽管阻遏物蛋白基因(argR)的核苷酸序列和由此推导的编码氨基酸序列已经在GenBank基因数据库中登记(AF049897)，但该基因之所以被命名为argR据信是因为在上述氨基酸序列和已知精氨酸阻遏物之间存在同源性。同时，最近鉴定了具有将L-氨基酸分泌到微生物菌体外功能的特异性蛋白质和基因，特别是，Vrlijc et al.鉴定了一个涉及棒状杆菌细菌菌体外分泌L-赖氨酸的基因 (Vrlijc M.，Sahm H.，Eggeling L.，MolecularMicrobiology, 22 :815-826 (1996))。该基3因被命名为lysE，有报道指出，通过在棒状杆菌细菌中增强该基因表达，可以改善棒状杆菌细菌生成L-赖氨酸的能力(W097/23597)。而且，已知在大肠杆菌中增加氨基酸分泌蛋白的表达量，可以改善某些L-氨基酸的产量(日本专利公开号2000-189180)。例如，业已报道，通过将多拷贝yggA基因导入大肠杆菌，可以改善赖氨酸和精氨酸的产量(日本专利公开公告号2000-189180)。而且，有报道指出，通过在大肠杆菌中增加0RF306基因的表达，可以改善胱氨酸、半胱氨酸等的产量(EP88596》。但是，IysE基因是否具有分泌L-赖氨酸以外其他氨基酸的功能，目前尚不知晓。
技术实现思路
本专利技术的一个目标是改善微生物生产L-精氨酸的能力，并提供有效制备L-精氨酸的方法。所述微生物如棒状细菌和属于埃希氏菌属的细菌。在研究L-精氨酸生产细菌的过程中，本专利技术的专利技术者发现，可以通过增强IysE基因的表达来改善L-精氨酸的生产能力。而且，他们还发现，可以通过增强IysE基因，同时破坏argR基因或增强L-精氨酸生物合成途径中的酶活性，显著改善L-精氨酸的生产能力， 进而实现本专利技术目标。即，本专利技术提供了以下方面。(1)具有L-精氨酸生产能力的微生物，所述微生物经过修饰，使IysE基因的表达增强。(2)根据(1)的微生物，其中通过增加IysE基因的拷贝数或者修饰IysE基因的表达调控序列来增强IysE基因的表达，这样微生物细胞内IysE基因的表达水平得到增强。(3)根据⑴或⑵的微生物，所述微生物经进一步修饰，使精氨酸阻遏物不能发挥正常功能。(4)根据(3)的微生物，其中精氨酸阻遏物不能发挥正常功能是因为染色体上编码精氨酸阻遏物的基因被破坏。(5)根据(1)-(4)的任一微生物，所述微生物经进一步修饰，使细胞内L-精氨酸生物合成途径中的酶活性得到增强。(6)根据(1)-( 的任一微生物，其中所述微生物是棒状细菌。(7)根据(1)-(5)的任一微生物，其中所述微生物是属于埃希氏菌属的细菌。(8)制备L-精氨酸的方法，包括在培养基中培养根据(1)-(7)的任一微生物，并在培养基中产生、积累L-精氨酸，然后从培养基中收获L-精氨酸。本专利技术中，“生产L-精氨酸的能力(产L-精氨酸能力)，，意味着当微生物在培养基中培养时，本专利技术微生物在培养基中积累L-精氨酸的能力。这种产L-精氨酸能力可以是微生物作为野生型菌株天然拥有的，也可以是通过培养获得的或得到增强的。根据本专利技术，微生物的产L-精氨酸能力能够得到改善，所述微生物如具有L-精氨酸生产能力的棒状细菌或属于埃希氏菌属的细菌。附图说明图1显示了质粒pKl的构建过程。图2显示了质粒pSH(6的构建过程。图3显示了质粒pSH(T2的构建过程。4图4显示了质粒plysE的构建过程，所述质粒含有lysE。图5显示了质粒pargCJBDFGH和pargCJBDFGH-E的构建过程，所述质粒 pargCJBDFGH含有L-精氨酸生物合成酶基因，不含argR基因，质粒pargCJBDFGH-E含有 IysE和L-精氨酸生物合成酶基因。图6显示了含有tac启动子的pRMac的构建，以及质粒pRSlysE的构建，后者通过将IysE基因插入质粒pl^tac获得。具体实施方式从此往后，本专利技术将给予详细阐述。<1>本专利技术微生物本专利技术微生物是具有产L-精氨酸能力的微生物，并经过修饰，使IysE基因的表达得到增强。本专利技术微生物可以通过下述途经获得，包括增加具有产L-精氨酸能力的微生物的IysE基因表达，或者通过增加微生物IysE基因的表达使微生物获得产L-精氨酸的能力。本专利技术微生物的特异性实例包括具有IysE基因或IysE基因同系物的微生物，具体地说，包括棒状细菌，属于芽孢杆菌属、沙雷氏菌属或埃希氏菌属的细菌，属于酵母菌属或念珠菌属的酵母菌。在这些细菌中，优选棒状细菌和属于埃希氏菌属本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物，所述微生物具有产Ｌ－精氨酸的能力，并经过修饰，使ｌｙｓＥ基因的表达得到增强。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：山口美喜子，伊藤久生，郡司义哉，安枝寿，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]