氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸/纤维素亲和力功能区细胞贴附因子及其制造方法技术

一种细胞贴附效率改良的ＣＢＤ／ＲＧＤ重组贴附因子及其制造方法，其是于将调控细胞贴附作用的ＲＧＤ氨基酸（ａｍｉｎｏａｃｉｄ）序列（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）结合于一段具有纤维素亲合力功能区［ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ（ＣＢＤ）］的Ｃ端，借此ＣＢＤ－ＲＧＤ胜肽以可促进细胞贴附于纤维素培养盘中，多加一段ＲＧＤ序列，且使之存在于双硫键架起来的稳定环状结构内，并结合于所述具有纤维素亲和力功能区［ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ（ＣＢＤ）］的Ｎ端，构成ＣＢＤ／ＲＧＤ重组贴附因子，而可大大提升其促进细胞贴附能力。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是有关一种增进细胞贴附效率的方法，尤其是有关一种重组CBD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)/RGD(纤维素亲和力功能区)细胞贴附因子及其制造方法。贴附依赖性细胞在无血清培养液中的培养，通常需要另加入一些贴附因子(请参文献Clement，B.，Segui-Real，B.，Savagner，P.，Kleinnam，H.K.，Vamada，Y.1990.J.Cell Biol.110185-192)，这对于在微载体上大量的细胞培养特别重要，因为细胞一开始的贴附条件较为严苛(请参文献Steele，J.G.，Johnson，G.，Norris，W.D.，Underwood，P.A.1991 Biomaterials 12531-539)。1967年，Wezel首先发表了微载体(microcarrier)(请参文献Wezel，A.L.V.1967.Nature.21664-65)，利用带电荷的圆珠〔beads〕状物质，提供较大的单位生长表面积，可以令贴壁性细胞吸附于圆珠上，作大量的培养，并且方便配合各种生物反应器(bioreactor)设计，进行大规模的细胞或细胞产物的生产(请参文献Chen，Z.，Y.Chen and Y.Shi.1992.Can.J.Microbiol.38222-225.Pierre，J.，J.Lapierre，C.Daniel，R.Dugreand P.Trepanier.1989.J.Virol.Methods.2563-70.Hu，W.S.1985.Biotech.Bioeng.27585-595)。自此，固定化细胞培养技术(immobilized cellculture technology)开始迅速的被研究发展。固定化细胞培养技术研发的重点之一，便是固定化细胞材质的开发。目前广泛被应用的固定化细胞材质包括了用来制作微载体的带正电葡聚糖(dextran)(DEAE，diethylaminoethyl)、胶原蛋白(Collagen)等。其他还有空心纤维(hollow fier)、陶材(ceramicmatrices)等等。这个固定化细胞的材质大多已经商品化，虽然有效，但价格昂贵，过去曾有研究者利用天然纤维素来作为培养固定化细胞的材质；天然纤维素的好处是能够提供很大的生长表面积、价格低廉、容易取得、且合乎环保原则，但是动物细胞在纤维素材质上的贴附生长效率并不理想(请参文献Wierzba，A.，U.Reichl，R.F.B.Turnner，R.A.J.Warren andD.G.Kilburn.1995.Biotech.Bioeng.47147-154；Wierzba，A.，U.Reichl，R.F.B.Turnner，R，A.J.Warren and D.G.Kilburn.1995.Biotech.Bioeng.46185-193)。另外，生长培养液可添加一些各别的细胞外间质糖蛋白，但同样的，其纯化的花费高昂，并且，同样会导致污染，因此相当值得开发重组贴附因子。下面再对先前技术作详细描述细胞在活体(In vivo)状况下的吸附(attachment)、伸展(spreading)、分化〔differention〕及移动(migration)是近年肿瘤学研究的重点之一；活体状况下，大多数的正常细胞都是固定于细胞外间质(extracellular matrix)上(请参文献Freshney，R.I.1986.Animal Cell Culture 2nd ed.OxfordUniversity Press，New York.)。细胞外间质是由细胞的生理合成产物运输到细胞膜外堆积而成，营养物质与病源体进入细胞或代谢物排出细胞，都必须经过细胞外间质。细胞外间质包含一些典型非胶原蛋白的贴附因子，都具有多重功能区(domain)，每一个功能区都具有结合至间质大分子和细胞表面接受器的特殊结合序列，这些蛋白具有重组间质并帮助细胞贴附至间质的功能，其中最为熟知的，为发现存在所有脊髓动物细胞纤维网蛋白(fibronectin)的糖蛋白大分子，纤维网蛋白的糖蛋白大分子被认为具有发动细胞贴附、分化及移动的功能(请参文献Hynes，R.O.1986.Fibronectins，Sci.Am.25442-51；Freshney，R.I.1994.Cultrueof Animal Cell.3th ed.Wiley Liss，New York)。纤维网蛋白的糖蛋白大分子是由二个次单位所组成，并且在二个次单位的C端以双硫键相连结，每一次单位会被折叠成一连串的功能区并由可弯曲的多胜肽链分离，这些功能区包括胶原蛋白结合(collagen-binding)、纤维结合(fibri-binding)、肝素结合(haparin-binding)及细胞结合(cell-binding)等(请参文献Hynes，R.O.1990.Fibronectin.1sted.Springer-Verlag，New York.)。纤维网蛋白(fibronectin)经低浓度的蛋白水解酶处理后，其中一个功能区(domain)具有结合至胶原蛋白(collagen)的功能，其他功能区(domain)尚可结合至肝素(haparin)和其他位于不同种细胞表面的特殊接受器。科学家证实具促进细胞贴壁功能的功能区(domain)上有特别的三个氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，为纤维网蛋白(Fibronectin)促进细胞贴壁的最小功能单位(请参文献Ruoslahti，E.andM.D.Pierschbacher.1987.Science.238491-496)。如果这些氨基酸被螯合至细胞培养材质表面，氨基酸会帮助细胞结合至这些固态材质上，RGD序列并非只限于出现在纤维网蛋白(fibronectin)上，许多其他细胞外间质蛋白都含有此序列。RGD序列具功能与否，乃决定于RGD序列在整个蛋白质结构中是否处于一个容易受到外界影响的位置(请参文献Hautanen，A.，J.Gailit，D.M.Mann and E.Ruoslahti.1989.J.Biol.Chem.2641437-1442)，例如纤维网蛋白(Fibronectin)中有促进细胞贴壁功能的RGD序列便是位于贝他转折处(b-turn)，裸露在整个构形的最外面(请参文献D’Souza，S.E.，M.H.Ginsberg and E.F.Plow.1991.TIBS.16246-250)。另外，RGD序列活性的强弱，似乎也受到了邻近几个氨基酸甚至更远的一些氨基酸的影响，但确实机制仍不明了(请参文献Ruoslahti，E.andY.Yamaguchi.1991.Cell.64867-869；Tranqui，L.，A.Andrieux，G.Hudry，J.Clergeon，J.Ryckewaert，S.Soyze，A.Chapel，M.H.Ginsberg，E.F.Plow andG.Marguerie，1989.J.Cell Biol.1082519-2527)。细胞间质利用与细胞表面的接受器结合，引发细胞内一连串的生物化学反应，使细胞发生生理及形态的改变而影响整个细胞架构，如果细胞生长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞贴附效率改良的ＣＢＤ／ＲＧＤ重组贴附因子，其特征是其是于将调控细胞贴附作用的ＲＧＤ氨基酸序列（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）结合于一段具有纤维素亲合力功能区［ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（ＣＢＤ）］的Ｃ端，利用此ＣＢＤ－ＲＧＤ胜肽以可促进细胞贴附于纤维素培养盘中，多加一段ＲＧＤ序列，且使之存在于双硫键架起来的稳定环状结构内，并结合于所述具有纤维素亲和力功能区［ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（ＣＢＤ）］的Ｎ端，构成可提升促进细胞贴附能力的ＣＢＤ／ＲＧＤ重组贴附因子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林佳慧，
申请(专利权)人：三九生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]