本发明专利技术属生物化学领域，具体涉及一种活性肽类物质精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸细胞粘附三肽的制备方法。过程主要有二肽合成、三肽合成等步骤，生产中不需要脱除保护基。是以天冬氨酸为原料，包括氯乙酰氯与天冬氨酸的反应得到氯乙酰化天冬氨酸、氯乙酰化天冬氨酸氨解得到甘氨酸－天冬氨酸二肽、苄氧羰基精氨酸（Ｚ－Ａｒｇ－ＯＨ）与三溴化磷反应得到氮羧基内酸酐精氨酸（ＮＣＡ－Ａｒｇ）、氮羧基内酸酐精氨酸（ＮＣＡ－Ａｒｇ）与甘氨酸－天冬氨酸二肽反应得到精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸三肽等步骤。本发明专利技术所述方法具有简化工艺、降低成本、减少工时、安全操作的优良效果，能够制备高纯度、高活性的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸三肽产品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物化学领域，具体涉及一种活性肽类物质精氨酸-甘氨酸-天冬氨 酸细胞粘附三肽的制备方法。
技术介绍
细胞外基质及基底膜中的纤维连接蛋白(Fn)、玻璃体连接蛋白(VN)、 胶原蛋白(Collagen)、血管性假血友病因子(vWF)等均含有一高度保守的 氨基酸序列一精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列。美国癌症研究中心的 Pierschbacherherhe和Puoslahti于1984年首次发现并鉴定了此三肽的细胞粘附作用。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是整联蛋白的主要识别位点，而整联蛋 白又是一类在细胞信号转导中发挥重要作用的细胞粘着因子，所以此三肽序列 可以模拟细胞外基质成分被整联蛋白所识别从而对细胞进行调节。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列在生物体内的功能很多。层粘连蛋白出现 于早期胚中，对于保持细胞间粘连，细胞的极性及细胞的分化都有重要意义。层 粘连蛋白也与肿瘤细胞的转移有关。而层粘连蛋白正是通过此三肽序列与细胞膜 上的整联蛋白结合，从而在胚胎发育及组织分化中发挥重要作用。在细胞外基质中的纤连蛋白中，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是其被细 胞识别的最小结构单位。其受体也为整联蛋白家族成员之一。纤连蛋白的功能主 要是介导细胞粘着。通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的 形状和细胞骨架的组织促进细胞铺展。在胚胎发育过程中，纤连蛋白对于许多类 型的细胞迁移和分化是必需的。在创伤修复中，纤连蛋白促进巨噬细胞和其他免 疫细胞迁移到受损部位。在血凝块形成过程中，纤连蛋白促进血小板附着于血管 受损部位。显微注射纤连蛋白受体的抗体或含此三肽序列的短肽可以阻断细胞的 迁移。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列与肿瘤细胞及其新生内皮血管表面的整 联蛋白受体结合，参与肿瘤细胞的浸润过程。粘附是癌细胞侵袭的始动步骤。肿 瘤细胞通过膜表面受体粘附于基底膜及细胞外基质成分。肿瘤细胞与细胞外基质 的多种成分(如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等)的相互粘着，是肿瘤转移过程的 重要环节，此类肽限制了肿瘤细胞向细胞外基质的粘附及转移。人工合成此肽类 的氨基酸序列，竞争性地与肿瘤细胞表面的整联蛋白受体结合，抑制细胞与基质 之间的粘附，达到抑制肿瘤细胞浸润、转移的目的。近年来，还发现此三肽在伤 口愈合、神经再生、皮肤修复等方面具有良好的作用。综上所述，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是多种生物细胞外基质和血浆 蛋白结构中常见的基本成分，也是广泛存在于细胞间识别系统的基本单位，能与 细胞表面整联蛋白特异性结合，从而介导许多重要的生命活动。外源性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽能与体内含此三肽序列的物质竞争结合整联蛋白，从而具 有一系列生物学功能。对于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽的合成已经分别有了酶法合成、化学法合 成、化学法与酶法相结合的方法来合成。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种工艺简化、成本降低、工时减少、操作安全的精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸细胞粘附三肽产品的制备方法。我们选择了液相化学法合成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽。所用的化学法并 不是经典的用带保护基的氨基酸进行的肽合成，而是利用廉价的不带有保护基的 氨基酸或只用苄氧羰基保护的氨基酸来合成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽。我们 之所以选择这种方法是因为这种方法与其他方法相比较费用较低、反应简单、效 率也是很高的。本专利技术是一种液相化学合成法，过程主要有二肽合成、三肽合成等步骤，生 产中不需要脱除保护基。是以天冬氨酸为原料，通过氯乙酰氯与天冬氨酸的反应 得到氯乙酰化天冬氨酸，氯乙酰化天冬氨酸氨解得到甘氨酸-天冬氨酸二肽；苄 氧羰基精氨酸(Z-Arg-OH)与三溴化磷反应得到氮羧基内酸酐精氨酸 (NCA-Arg);氮羧基内酸酐精氨酸(NCA-Arg)与甘氨酸-天冬氨酸二肽反应得 到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽。应用本专利所述方法，还可以合成其它的二肽、 三肽或多肽产品。具体工艺步骤如下(1 )取25克~35克L-天冬氨酸悬浮于40~60毫升、质量浓度为17%~27% 浓度氢氧化钠水溶液中使其完全溶解，用该浓度氢氧化钠水溶液调pH值8~12 之间，然后加入30~60毫升乙酸乙酯；在0'O1(TC的条件下，以0.10 ~0.20ml/min的速度分别滴加15~30毫升10~13mol/l氯乙酰氯和15~40毫升 170/0~27%氢氧化钠水溶液到上述溶液中，边滴加边搅拌，滴加过程中控制氢氧 化钠水溶液滴加速度保持溶液的pH在8~12范围内，滴加完毕，继续搅拌20~50分钟；结束反应时用浓盐酸调PH至3以下，然后将此反应液用乙酸乙酯抽提三 次，合并提取液，加无水硫酸钠干燥，减压除去乙酸乙酯，即得到氯乙酰化天冬 氨酸白色粉末；(2) 在0'O1(TC低温条件下，将所得到的氯乙酰化天冬氨酸按照1.0g: 5~10^11的比例加入质量浓度为25%~28%的浓氨水，搅拌24 48小时，然后减 压除去多余氨气，旋转蒸发得到微黄粘稠状物质，加入乙醇振摇并倒掉，再加入 乙醇搅拌至成粉末，旋转蒸发即得甘氨酸-天冬氨酸二肽白色粉末；(3) 于20m卜200ml四氢呋喃溶液中悬浮1g 10g的苄氧羰基精氨酸 (Z-Arg-OH)，于室温加入5m卜50ml含有三溴化磷的四氢呋喃溶液(V三溴化磷/V四氢呋喃"4)，室温搅拌3~5小时后，将反应液上层的四氢呋喃倾注下 去，下层为沉淀下来的比重较大的油状物，将此油状物反复用200 400ml的四 氢呋喃洗涤，真空干躁得淡黄色的焦油状物，即得氮羧基内酸酐精氨酸；(4) 在带有温度计、pH电极、外冷却装置和搅拌装置的容器中，将甘氨酸 -天冬氨酸二肽溶于pH 8 12的0.1 0.3mol/L的硼酸-硼酸钾缓冲体系中，体系 中甘氨酸-天冬氨酸二肽的含量是0.5mol/卜0.8mol/L用KOH调pH 8~12，加入 0.01~0.03毫升辛醇，在激烈搅拌下按氮羧基内酸酐精氨酸物质的量甘氨酸-天冬氨酸二肽物质的量为1~1.5: 1的比例， 一次加入氮羧基内酸酐精氨酸(NCA-Arg)，并不断加入1~2mol/l的KOH溶液保持pH为8~12， 2~8分种内 碱消耗结束，加入浓硫酸调pH到3以下终止反应；将上述反应液冻干，用少量 水溶解，用醇沉淀，抽滤得沉淀，用S印hadexG-10柱层析分离产物，得到本 专利所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽产品。氯乙酰基在合成中有三个作用1.是对氨基进行了保护；2.是对天冬氨 酸的羧基有活化作用；3.是氯乙酰基在氨解后可直接转化为所需的与天冬氨酸氨基成肽键的甘氨酸残基，省去了一步接氨基酸的步骤。 附图说明图1:本专利制备的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽的质谱图。通过图谱可知，峰值为347.2272与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽的分子量 Mw346相对应，确认为其质谱峰，证明产物为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽。具体的实施方式实施例1:氯乙酰化天冬氨酸的合成取25克L-天冬氨酸悬浮于40毫升、27。/。浓度氢氧化钠的水溶液中使其完 全溶解，然后用该浓度氢氧化钠水溶液调phN10，然后加入30毫升乙酸乙酯； 在0。C的条件下，以0.16ml/min的速度分别滴加15毫升12.54mol/l氯乙酰氯和 15毫升27%氢氧化钠到本文档来自技高网...
【技术保护点】
精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸细胞粘附三肽的制备方法，其包括如下步骤：（１）氯乙酰氯与天冬氨酸的反应得到氯乙酰化天冬氨酸；（２）氯乙酰化天冬氨酸氨解得到甘氨酸－天冬氨酸二肽；（３）苄氧羰基精氨酸与三溴化磷反应得到氮羧基内酸酐精氨酸；（４）氮羧基内酸酐精氨酸与甘氨酸－天冬氨酸二肽反应得到精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸三肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐力，张学忠，黄宜兵，王华，侯瑞珍，杨森，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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