利用枯草芽孢杆菌NX-2制备γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体制造技术

一种枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＸ－２，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：ＣＧＭＣＣ ＮＯ．０８３３。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及-种高产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和高产γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)的微生物菌株，以及将它用于γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体的生产。谷胱甘肽即N-(N-L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸(L-Glutathione、Glutathiol，简称为GSH)，它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽，其中谷氨酸是以γ-羧基与半胱氨酸形成肽键，其分子结构如下 GSH是一种非常重要的氨基酸衍生物，具有非常广泛的应用前景。作为试剂，谷胱甘肽广泛用于生化、医学、生物学、化学的研究与测定。临床上，它可用于肝炎的辅助治疗，有机物及重金属的解毒，癌症辐射和化疗的保护，白内障、HIV的抑制，细胞膜的保护，性功能的改善等；在食品加工中，谷胱甘肽作为食品添加剂可提高营养，加强食品风味及防止变质；谷胱甘肽还可制成复合治疗和保健的药品用于人体保健。GSH的制备方法有以下几种1、化学合成法采用常规的肽类合成方法，由L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸经多步的基团保护，接肽和脱保护过程，合成GSH。2、酵母提取法从富含GSH的酵母细胞中萃取得到GSH。3、酶法全合成利用γ-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶和GSH合成酶分别的催化作用合成，在能量ATP存在下，由L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸合成GSH。本专利技术的目的可以通过以下措施来达到本专利技术人实验室选育并保藏的微生物菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NX-2(以下简称为NX-2菌株)，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.0833保藏日期是2002年11月18日。以此菌作为生产菌株。NX-2菌株具有下述性质1、形态特征在肉膏琼脂培养基上营养细胞为0.7-1.0×1.3-2.0μm大小的杆菌，30℃培养2-3天形成芽孢，芽孢大小为0.7-0.9×1.0-1.5μm，为长圆形或圆柱形。2、在各种培养基上的特征(1)肉膏琼脂平板培养25-45℃培养1-3天可大量生长。菌落呈污白色，粗糙有皱褶，不透明，不闪光，蔓延，边缘不规则。(2)肉膏琼脂斜面培养同(1)(3)肉膏液体培养在液体表面形成菌膜，液体内部透明。(4)肉膏穿刺培养菌体在表面生长，底部不生长。3、生理生化性质NX-2菌株的生理生化性质见表1。表1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NX-2(CGMCC No.0833)生理生化性质 根据中国科学院微生物研究所鉴定NX-2菌株属于枯草芽孢杆菌。菌株培养该菌株用于γ-聚谷氨酸及其盐生产时，将菌株经斜面活化，液体培养在含谷氨酸的培养基中，30～37℃培养，可生成30-50g/lγ-聚谷氨酸，生产率高达0.8～2.5g.h-1·l-1。该菌株用于谷胱甘肽及其前体时，对NX-2菌株进行常规培养，培养基为葡萄糖1～10％，酵母膏1～5％，玉米浆1～5％，MgSO40.01～0.5％，K2HPO40.01～0.5％，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，以下同。pH6～9，装液量20～200ml/500ml三角瓶，100～120℃摇瓶培养20～50分钟。灭菌结束后，冷却，接种，接种量为1～10％，20～40℃摇瓶培养，转速100～220r/min。在上述条件下进行摇瓶发酵试验，培养20～50小时，产γ-谷氨酰转肽酶达1～5U/ml。γ-谷氨酰转肽酶活力测定方法在试管中依次加入0.1mol/lTris-HCl缓冲液(pH＝8)1.2ml，0.1MGly-Gly0.4ml，5mmol/lγ-谷氨酰对硝基苯胺0.4ml，组成反应底物。发酵液稀释1～50倍，取0.2ml加入反应底物中，置于37℃恒温水浴30分钟，于721分光光度计(λ＝410nm)测定吸光值。酶活力的单位定义在上述条件下，每分钟生成1μmol对硝基苯胺的酶量，定义为1个酶活力单位(U)。培养后的发酵液作为酶源，加入到以L-半胱氨酰L-甘氨酸或其前体和L-谷氨酸或L-谷氨酰胺组成的底物溶液中进行酶反应，生成谷胱甘肽及其前体。或者，对发酵液进行酶分离纯化后得到γ-谷氨酰转肽酶的酶制剂，配成酶液。或者，将γ-谷氨酰转肽酶的酶制剂进行固定化，固定化方法为用生理盐水将γ-谷氨酰转肽酶配成酶溶液，与1.5～6％，1～5倍量的卡拉胶溶液在35～55℃下混匀，冷却后加KCl溶液硬化制成固定化酶，以此作为酶源进行反应。除了卡拉胶作为固定化载体包埋外，还可以用海藻酸钙、明胶、甲壳素等载体包埋的方法。固定化细胞可反复回用，进行多次酶反应。酶转化反应加入γ-谷氨酰转肽酶的酶量为50-1000mU/ml，酶反应温度20～50℃，pH6.0～11.0，时间0.5～30小时。本专利技术采用化学-酶法工艺路线，通过化学合成法合成L-半胱氨酰L-甘氨酸或基团保护的前体，然后利用微生物产生的γ-谷氨酰转肽酶，以L-谷氨酸或L-谷氨酰胺为γ-谷氨酰基供体，酶法合成(L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸，即谷胱甘肽。该路线避免了化学全合成途径中γ-谷氨酰基接肽过程需要对有关的-NH2，-COOH基团进行保护和脱保护，工艺路线大大简化。该路线同酶法全合成途径相比，不需要供给ATP这一昂贵的原料，很符合实用性要求。将上述枯草芽孢杆菌NX-2菌株接种于该培养基中，37℃培养24h，摇瓶转速200r/ml。得到发酵液中γ-聚谷氨酸含量为30g/l，生产率为1.25g·h-1·l-1。将实施例2中发酵液1000ml，离心去除细胞，硫酸铵梯度盐析，过夜，用透析袋对自来水透析过夜，得γ-谷氨酰转肽酶粗酶，该酶制剂活力为80U/g，将该酶制剂用作酶源。由化学合成制备得的S-苄基半胱氨酰甘氨酸甲酯(SBCGM)和L-谷氨酰胺配成底物溶液，SBCGM的浓度为100mmol/l，L-谷氨酰胺浓度为100mmol/l。加入γ-谷氨酰转肽酶粗酶液，加入酶量为0.5U/ml。置37℃恒温水浴反应2～10小时，每隔30分钟取样进行高效液相分析。反应6小时，生成S-苄基谷胱甘肽甲酯，对SBCGM摩尔转化率60％。表2固定化酶反复分批转化结果 权利要求1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NX-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCCNO.0833。2.利用枯草芽孢杆菌NX-2制备γ-聚谷氨酸及其盐，其特征是将菌株NX-2经斜面活化，液体培养在含谷氨酸或其盐的培养基中，30-37℃培养，生成30-50g/lγ-聚谷氨酸，生产率高达0.8-2.5g·h-1·l-1。3.利用枯草芽孢杆菌NX-2制备谷胱甘肽及其前体，其特征是a.菌株NX-2进行常规培养，发酵产γ-谷氨酰转肽酶，发酵液的酶活力达1～5U/l；b.以L-半胱氨酸和L-甘氨酸为主要原料合成L-半胱氨酰L-甘氨酸或基因保护的前体，配成浓度为20-500mmol/l溶液，加入L-谷氨酸或L-谷氨酰胺，作为酶反应底物；c.将a的发酵液；或者对γ-谷氨酰转肽酶进行分离纯化，得到酶制剂，配成酶液；或者对γ-谷氨酰转肽酶酶制剂进行固定化；和b的酶反应底物溶液混合，反应生成谷胱甘肽及其前体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征是反应体系中加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐虹，欧阳平凯，李霜，韦萍，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：