同位素标记*N-L-苏氨酸的制备方法技术

一种大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ｐＴＨ０８＋ｐｒｈ－Ｔ０４）／ＶＴ４１８　　ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．０９２３。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种同位素标记15N-L-苏氨酸的制备方法，具体涉及一种利用微生物发酵制备15N-L-苏氨酸的方法，特别涉及一种发酵制备15N-L-苏氨酸的微生物。
技术介绍
氮-15(简称15N，下同)是氮元素的稳定同位素，作为示踪剂，它广泛应用于有机化学、生物化学、医学、药物学、农科等领域，尤其对生命科学的研究有极为重要的意义。特别是随着人类基因组序列图谱的测定和绘制完成，蛋白质的人工合成对推动世界上生命科学研究越来越重要，而15N-氨基酸在此过程中起到不可替代的独特示踪作用，其应用越来越广泛，市场前景良好。由于这类产品产量小，纯度及丰度要求高，通常用化学合成法生产。通常，化学合成法生产的氨基酸是DL型氨基酸，再经酶法拆分得到L型氨基酸。往往生物领域需要的是L型氨基酸，D型氨基酸大都废弃，导致15N-无机原料的利用率极低，生产成本极高，销售价格极高。发酵法生产氨基酸已经在世界范围普遍采用，但至今未发现用发酵法生产15N-L-苏氨酸的专利报道。存在以下原因(1)发酵法生物合成氨基酸由于其代谢途径非常复杂，副产氨基酸较多，对分离纯化带来一定困难；(2)也是由于生物合成氨基酸的复杂性，在发酵过程中往往需要添加一些天然的有机原料，如玉米浆、毛发水解液、酵母膏、大豆水解液等等，这些物质的添加将直接导致发酵产物的丰度值(15N/N)下降，不被市场接受。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题之一是公开一种能发酵生产15N-L-苏氨酸的细菌菌种，即基因工程构建的大肠杆菌。本专利技术需要解决的技术问题之二是公开一种用发酵法生产15N-L-苏氨酸的方法，以获得高纯度、高丰度的15N-L-苏氨酸产品，克服现有技术的缺陷。使用的微生物本专利技术用于生产15N-L-苏氨酸的微生物是一种用基因工程方法构建的大肠杆菌(E.coli)(pTH08+prh-T04)/VT418，该菌种已于2003年4月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.0923。上述菌种具有如下的性质1.形态生理生化特征形态特征直杆状，1.1-1.5μm×2.0-6.0μ，革兰氏阴性，发酵液中单个存在，在营养琼脂培养基上菌落光滑、湿润、表面有光泽。生理生化特征AHVr，Met-，Ile-’Dap-。2.在各种培养基上的特征固体斜面分离培养基蔗糖2.0g，NH4Cl1.0g，KH2PO41.5g，Na2HPO43.5g MgSO4·7H2O20.0g，琼脂20g，溶解后调pH7.0～7.2，加蒸馏水溶解并定容1000ml，0.8Kg/cm2灭菌30分钟，冷却至50℃时加入氨苄青霉素溶液，使最终浓度为50μg/ml。液体增殖培养基蔗糖40.0g，(NH4)2SO410.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母浸出物2.0g，CaCO315.0g，加蒸馏水溶解并定容1000ml，0.8Kg/cm2灭菌30分钟，冷却至50℃时加入氨苄青霉素溶液，使最终浓度为50μg/ml。发酵培养基碳源葡萄糖、蔗糖、果糖等一种或多种。氮源15N-硫酸铵、15N-氯化铵、15N-尿素、15N-硝酸铵等一种或多种。营养成分磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜等一种或多种。3.培养条件培养温度30-40℃，更适宜的温度36-38℃。培养方式通风搅拌耗氧发酵。发酵过程中控制溶解氧浓度10-60％、更适宜在20-30％。发酵过程中控制pH值5.5-7.0，更适宜在5.8-6.2。发酵过程中采用中和剂氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等。本专利技术所用菌种的来源本专利技术所采用基因工程构建菌种E.coli(pTH08+prh-T04)/VT418，具体的非限制性地构建方式可以以下方式进行选择大肠杆菌野生型菌株E.coli MC4100为出发菌株，通过uv、亚硝基胍(NTG)和硫酸二乙酯(EDS)为诱变剂，通过诱变选育解除了苏氨酸生物合成反馈调节突变型以筛选苏氨酸高产菌株VNBKB-3507(AHVr，Met1，DAP-，Ile+)和受体菌株VT418(Thr-，AHVr，Met1，DAP-，Ile+)。将该出发菌株中的编码苏氨酸代谢途径的三个关键酶AKI-HDI、HKI及苏氨酸合成酶的基因操纵子(thrA、thrB、thrC)克隆到质粒pET11a的T7噬菌体启动子下，构建质粒pET11a-08。将负责高丝氨酸和高丝氨酸内酯分泌的rhtB基因与负责苏氨酸分泌的rhtC基因连接到带T7噬菌体启动子的大肠杆菌质粒上构建分泌基因质粒prh-T04，并在受体菌株大肠杆菌VT418中表达。采用《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠、蔡妙英编著)所述的鉴别方法和上述的试验数据表明，本专利技术的所述及的菌种(pTH08+prh-T04)/VT418属于大肠杆菌，但是又与大肠杆菌有着明显的区别，其主要不同点在于该菌种携带具有强启动子的苏氨酸操纵子基因和有利于苏氨酸分泌的基因质粒，具有高产苏氨酸特征。本专利技术所采用的分析方法采用斐林氏方法测定还原糖；采用HPLC方法测定苏氨酸含量；采用微量样品转化方法制备样品，由气体同位素质谱计检测15N-苏氨酸丰度。采用上述菌种发酵生产15N-L-苏氨酸的方法包括如下步骤将所说的菌种在培养基中35-38℃扩增18-24小时后，在无菌条件下洗涤并收集菌体接入含有碳源、15N-氮源及其它营养成分的培养基中进行通风搅拌发酵培养，培养温度为30-40℃，更适宜的温度为36-38℃，发酵过程中控制溶解氧浓度为10-60％，更适宜在20-30％，以氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等碱性物质的一种或多种调节发酵液pH值为5.5-7.0，更适宜在5.8-6.2，培育时间为36-48小时。所说的培养基优选上述的液体增殖培养基。所说的碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖或乳糖等糖质原料中一种或一种以上。所说的15N-氮源包括15N-硫酸铵、15N-氯化铵、15N-尿素、15N-硝酸铵等中的一种或一种以上。所述及的15N-氮源可采用上海化工研究院生产并公开销售的硫酸铵、氯化铵等产品。所说的营养成分包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜等无机盐中的一种或一种以上。本专利技术还涉及从发酵液中提取纯化15N-L-苏氨酸的方法，该方法包括如下步骤将发酵成熟的发酵液用酸性物质调节pH值1-3，加热到80-100℃维持10-30分钟，用离心或过滤或微滤等方式除去菌体，将上清液以100-1000ml/h速度进入强酸性阳离子树脂(如#732)吸附，吸附完成后用500-5000ml纯水洗涤离交柱至流出液pH5-7，用2-10wt％的碱性溶液洗脱，收集洗脱液，用1-5％活性炭脱色，减压真空浓缩至15-30％浓度，加入3-5倍无水酒精沉淀，真空过滤，在60-80℃干燥，可得到纯度在99％以上、丰度在98.5％以上的15N-L-苏氨酸成品。所说的酸性物质包括硫酸、盐酸或硝酸；所说的碱性溶液包括氨水或氢氧化钠中的一种及其混合物。由上述公开的技术方案可见，本专利技术的方法，能够方便地制备同位素标记15N-L-苏氨酸，产品纯度在99％以上、丰度在98.5％以上，由此可见，本专利技术具有较大的工业化实施前景。具体实施例方式本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：章健，项泽宇，孙建荣，
申请(专利权)人：上海新立工业微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：