同位素标记15N-L-谷氨酰胺的制备方法技术

本发明专利技术涉及同位素标记［１５］↑Ｎ－Ｌ－谷氨酰胺的制备方法，该发明专利技术利用有机合成的方法，得到含有酰胺基标记［１５］↑Ｎ的Ｌ－谷氨酰胺。该方法克服了常规化学合成［１５］↑Ｎ－ＤＬ－谷氨酰胺，再经拆分得到双标记［１５］↑Ｎ－Ｌ－谷氨酰胺的缺陷，使得［１５］↑Ｎ－无机原料和［１５］↑Ｎ标记Ｌ－谷氨酸的利用率大幅提高；最终［１５］↑Ｎ－无机原料的利用率在７０％以上，提纯得到的产品纯度在９９％以上，丰度在９８％以上。本发明专利技术适用于γ－［１５］↑Ｎ标记或α－、γ－双［１５］↑Ｎ标记的Ｌ－谷氨酰胺的合成。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种同位素标记15N-L-谷氨酰胺的制备方法，具体涉及利用有机合成的方法，制备γ-15N和α-、γ-双15N标记L-谷氨酰胺。
技术介绍
氮-15(简称15N，下同)是氮元素的稳定同位素，可以用作示踪剂，广泛应用于生物化学、医学、药物学、农业科学等领域，尤其对生命科学研究有极为重大的意义。特别是在蛋白质的人工合成方面，氮-15氨基酸起着独特的示踪作用，其应用越来越广泛，市场前景良好。由于此类产品产量小，对纯度和丰度要求高。目前主要是通过化学合成法或生物发酵法生产。化学合成法设备要求简单，生产的氨基酸是DL型氨基酸，丰度高，但不具有光学活性，需要再经化学或酶法拆分得到L型氨基酸。D型氨基酸大多被废弃，导致氮-15原料利用率降低，增加了生产成本。生物发酵法具有反应步骤少，产品光学纯度高的优点。但需要较大的设备投入，对菌种的要求高，后提取步骤较多。L-谷氨酰胺是构成蛋白质的主要成分之一，其酶法生产较为困难。目前国内外报导的方法以化学合成法为主。主要以L-谷氨酸同甲醇用盐酸或干燥的HCl气体为催化剂，生成中间体L-谷氨酸-γ-甲酯盐酸盐，再加入过量二硫化碳和氨水后氨解得到L-谷氨酰胺；或由L-谷氨酸-γ-甲酯与水合肼等反应得酰肼，再加氢还原后得到L-谷氨酰胺。以上方法消耗大量氨水或其它有机胺类物质，是常用的L-谷氨酰胺生成方法，不适用同位素标记15N-L-谷氨酰胺的合成。目前尚未看到由化学合成法生成同位素15N标记L-谷氨酰胺的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供一种工艺简单、15N原料利用率高的同位素标记15N-L-谷氨酰胺的制备方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现1.一种同位素标记15N-L-谷氨酰胺的制备方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤(1)酯化反应将原料L-谷氨酸分散在醇类溶剂中，60℃～150℃回流温度下逐渐加入无机或有机酸催化剂，并在此温度下反应5～25小时；用乙醚重结晶得到L-谷氨酸二酯盐固体；L-谷氨酸、醇、催化剂的用量比为1∶5～40∶0.2～1.5；(2)选择性裂解将L-谷氨酸二酯盐分散在冰乙酸中，在30℃～90℃下，逐滴滴加恒沸HI酸，反应4～30小时，反应母液经减压脱除溶剂后，加入适量有机胺中和，放置后过滤得到L-谷氨酸-α-酯固体；L-谷氨酸二酯盐、乙酸、HI酸的用量比为1∶5～100∶1～5；(3)酰氯化将L-谷氨酸-α-酯固体、氯化亚砜于回流和搅拌下反应2～10小时，除去溶剂并蒸馏后得到产物α-酯-L-谷氨酰氯；(4)酰胺化将α-酯-L-谷氨酰氯的乙醚溶液、氢氧化钠水溶液混合后，加入非标记或15N标记无机氮源，在-10℃～20℃低温下条件下氨解1～10小时，冷却、提取和干燥后，蒸去溶剂得到α-酯-L-谷氨酰胺产品；(5)解保护将15N标记α-酯-L-谷氨酰胺通过皂化或加氢的方法脱除α-酯，得到同位素标记15N-L-谷氨酰胺。所述的醇类溶剂选择甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或苯甲醇中的一种或几种的混合物。所述的无机或有机酸选择盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氯化亚砜、三氯氧磷、对甲苯磺酸中的一种或几种。所述的原料L-谷氨酸包括非标记或15N标记的L-谷氨酸。所述的用量比为摩尔比。所述的解保护工艺得到的产品为γ-15N标记或α-、γ-双15N标记的L-谷氨酰胺。本专利技术提供了一套15N标记L-谷氨酰胺的制备方法，该方法在现有的有机合成L-谷氨酰胺技术的基础上，结合15N原料昂贵的特点，对了工艺条件进行改变，使之具有良好的经济性和使用价值。该方法适用于合成γ-和α、γ双15N标记L-谷氨酰胺。本方法过程简单，15N原料利用率高，得到的L-谷氨酰胺产品纯度在99％以上，丰度在98％以上。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1一种同位素标记15N-L-谷氨酰胺的制备方法，该方法包括以下工艺步骤(1)酯化反应将14.7g(0.1mol)L-谷氨酸、19克一水对甲苯磺酸和30ml苯悬浮分散在80ml苯甲醇中，配备油水分离器，于110℃回流24小时，加入过量乙醚沉淀、重结晶后得到L-谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸32.4g(单程收率65％)，熔点139.5～141.1℃。反应母液经减压脱除乙醚后，补加适量酸和苯甲醇，回流下继续反应5～20小时，至薄层层析显示无L-谷氨酸存在。参照以上步骤处理仍可得到10.2gL-谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸，合并后酯化总收率85.3％。(2)选择性裂解反应将10g(0.02mol)L-谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸溶解于100ml冰乙酸中，加入10ml脱色恒沸HI酸，50℃下反应8小时。母液脱除溶剂后加适量三正丁胺中和后，放置冰箱过夜。析出的晶体经过滤、洗涤后得3.2gα-苄酯L-谷氨酸(收率67％)，熔点145～147℃，25D＝+12.3°(c＝2.90.1N HCl)。(3)酰氯化反应将2.4g(0.01mol)α-苄酯L-谷氨酸悬浮在200ml无水乙醚中，0.012mol的氯化亚砜于回流和搅拌下反应2.5小时，除去溶剂并蒸馏后得到2.2gα-酯-L-谷氨酰氯固体(收率87％)。(4)氨解反应取含1.09g15NH4Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氢氧化钠1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及5.1gα-酯-L-谷氨酰氯的50ml苯溶液处理。混合物经冷却、过滤、提取后，最后得到4.5gα-苄酯-L-谷氨酰胺(15N收率95％)。(5)解保护将4.5gα-酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml甲醇中，加入0.5g 5％Pt/C催化剂，于常压下加氢反应5小时，母液经浓缩、提取后得到2.42gγ-15N标记L-谷氨酰胺(收率87％)，熔点183～185℃，20D＝+32.3°(c＝10 2N HCl)。实施例2一种同位素标记15N-L-谷氨酰胺的制备方法，该方法包括以下工艺步骤(1)酯化反应将14.7g(0.1mol)L-谷氨酸和30ml苯悬浮分散在80ml苯甲醇中，配备油水分离器，向其中通入过量无水氯化氢气体，于60℃回流12小时，加入过量乙醚沉淀、重结晶后得到L-谷氨酸二苄酯盐酸盐20.7g(单程收率57％)，熔点99.5～101.1℃。反应母液经减压脱除乙醚后，补加适量酸和苯甲醇，回流下继续反应5～10小时，至薄层层析显示无L-谷氨酸存在。参照以上步骤处理仍可得到7.1gL-谷氨酸二苄酯盐酸盐，合并后酯化总收率76.4％。(2)选择性裂解反应将7.3g(0.02mol)L-谷氨酸二苄酯盐酸盐溶解于80ml冰乙酸中，加入10ml脱色恒沸HI酸，50℃下反应12小时。母液脱除溶剂后加适量三正丁胺中和后，放置冰箱过夜。析出的晶体经过滤、洗涤后得2.7gα-苄酯L-谷氨酸(收率57％)，熔点144～146℃，25D＝+12.3°(c＝2.90.1N HCl)。(3)酰氯化反应将2.4g(0.01mol)α-苄酯L-谷氨酸悬浮在200ml无水乙醚中，0.012mol的氯化亚砜于回流和搅拌下反应2.5小时，除去溶剂并蒸馏后得到2.2gα-酯-L-谷氨酰氯固体(收率87％)。(4)氨解反应取含1.09g15NH4Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氢氧化钠1.2g(0.03m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同位素标记［１５］↑Ｎ－Ｌ－谷氨酰胺的制备方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤：（１）酯化反应将原料Ｌ－谷氨酸分散在醇类溶剂中，６０℃～１５０℃回流温度下逐渐加入无机或有机酸催化剂，并在此温度下反应５～２５小时；用乙 醚重结晶得到Ｌ－谷氨酸二酯盐固体；Ｌ－谷氨酸、醇、催化剂的用量比为１∶５～４０∶０．２～１．５；（２）选择性裂解将Ｌ－谷氨酸二酯盐分散在冰乙酸中，在３０℃～９０℃下，逐滴滴加恒沸ＨＩ酸，反应４～３０小时，反应母液经减压脱除溶 剂后，加入适量有机胺中和，放置后过滤得到Ｌ－谷氨酸－α－酯固体；Ｌ－谷氨酸二酯盐、乙酸、ＨＩ酸的用量比为１∶５～１００∶１～５；（３）酰氯化将Ｌ－谷氨酸－α－酯固体、氯化亚砜于回流和搅拌下反应２～１０小时，除去溶剂并蒸馏后得 到产物α－酯－Ｌ－谷氨酰氯；（４）酰胺化将α－酯－Ｌ－谷氨酰氯的乙醚溶液、氢氧化钠水溶液混合后，加入非标记或［１５］↑Ｎ标记无机氮源，在－１０℃～２０℃低温下条件下氨解１～１０小时，冷却、提取和干燥后，蒸去溶剂得到α－酯－Ｌ －谷氨酰胺产品；（５）解保护将［１５］↑Ｎ标记α－酯－Ｌ－谷氨酰胺通过皂化或加氢的方法脱除α－酯，得到同位素标记［１５］↑Ｎ－Ｌ－谷氨酰胺。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗勇，王博，强歌，陆平晔，李美华，
申请(专利权)人：上海化工研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]