本发明专利技术涉及一种稳定同位素标记的［１５］↑Ｎ－Ｌ－天冬氨酸的制备方法，该制备方法包括以下工艺步骤：（１）发酵产酶所采用的微生物：大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ １１３０３或ＣＧＭＣＣ１．８８１；（２）斜面培养；（３）发酵培养；（４）酶反应；（５）提取精制及［１５］↑Ｎ的回收。与现有技术相比，本发明专利技术已建立起一套实验室规模的生产工艺，体现出了酶法制备［１５］↑Ｎ－Ｌ－氨基酸的优越性，有利于［１５］↑Ｎ利用率的提高及后提取工艺的简化，减少了生产成本，提高了产品品质，以较高的［１５］↑Ｎ利用率得到丰度下降值很小的产品，且提取得率很高，大大提高了产品的市场竞争力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种15N-L-天冬氨酸的制备方法，具体地说是涉及一种以大肠杆菌游离整体细胞作酶源来制备稳定同位素标记的15N-L-天冬氨酸的方法；属于稳定性同位素标记化合物生产领域，涉及到微生物酶和生物下游分离技术。
技术介绍
由于15N比普通的14N多一个质量单位，而且其核自旋I＝1/2，具有核磁共振信号，因此可利用它的质量效应和同位素效应，借助质谱等测试技术，获得宝贵的结构信息。所以无放射性的稳定同位素标记的氨基酸因有着独特的示踪作用而得到广泛的应用。15N标记的氨基酸，是研究人体蛋白质代谢和个别氨基酸代谢，以及氨基酸之间转氨作用的不可缺少的示踪物。随着人类基因图谱的测定、蛋白质工程的发展及其他相关科学的快速发展，15N-L-天冬氨酸等标记氨基酸将在医学、药物学、生物学、生命科学、农业科学、有机化学等领域得到更为广泛的应用。传统的生产15N-L-氨基酸的方法可采用有机合成法、微生物发酵法或酶法及标记蛋白质分解分离制备法等。采用合成法比较简单，但需要光学拆分使15N原料利用率大为降低，成本上升。标记蛋白质分解分离制备法常用于制备复合氨基酸，要分离得到单一氨基酸很难。采用酶法生产15N-L-天冬氨酸，产物较单一，杂酸很少，分离比较简单。但由于培养酶液的发酵配方中存在有机氮源，常使15N-L-天冬氨酸的丰度下降较多达不到产品质量要求。故需对丰度下降及15N的利用率加以技术上的控制。目前，在15N稳定性同位素标记L-天冬氨酸的生产领域中仅见一篇国内专利报道，申请号为03141991.7。该专利申请的丰度下降值较大，15N的利用率较低，并未述及反应残余的15N原料的回收。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种稳定同位素标记的15N-L-天冬氨酸的制备方法，该制备方法通过采用游离整体细胞酶法生产15N-L-天冬氨酸的技术路线，旨在以一定的技术条件缓和15N丰度下降的问题，并尽量提高15N利用率。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现一种稳定同位素标记的15N-L-天冬氨酸的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下工艺步骤(1).发酵产酶所采用的微生物大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 11303或CGMCC 1.881；(2).斜面培养培养基为营养肉汁琼脂培养基(g/L)蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0，琼脂15.0，蒸馏水1.0L，pH值6.8～7.2，定容至1.0L，分装，0.1MPa(121℃)灭菌20分钟，菌种接入后28℃～32℃培养16～24小时；(3).发酵培养以碳源、氮源、微量元素离子配置成发酵培养基，调节其pH值5～9，灭菌后接入大肠杆菌斜面种子，于150～260rpm，22℃～40℃，培养16～24小时；装液量为50ml/500ml，灭菌条件为0.1MPa(121℃)，20分钟；菌体的生长浓度通过分光光度法加以分析；(4).酶反应底物反应液(g/L)底物反丁烯二酸的浓度为50g/L～200g/L，以100g/L～150g/L为较佳，加入微量元素离子及15N氮源后用NaOH调节pH值为7.5～9.5；将发酵所得游离整体细胞作为酶源加入底物溶液中，菌体加入量0.5重量％～1.2重量％，在30℃～50℃下，更适宜的35℃～40℃反应20～28小时，中间经取样以分光光度法测试反丁烯二酸的浓度小于0.25重量％时停止反应；反应过程中及最终反应结束时反丁烯二酸的浓度通过紫外分光光度法来测定，从而可计算出转化率；(5).提取精制及15N的回收反应结束后，将酶反应液进行离心，上清液于旋转蒸发仪上赶氨浓缩，所溢出氨加以吸收回收，直至冷凝液pH值为6.5～7.5；然后将该溶液加热至75℃～85℃，加入0.2～0.8重量％活性炭脱色30～45分钟，过滤得无色滤液；将滤液置于恒温磁力搅拌器或旋转蒸发仪上加以浓缩至原来体积的1/5～1/3，待温度维持在60℃～70℃，加入盐酸等酸调节pH值至2.80～3.00，逐渐有晶体析出；冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于50℃～60℃真空烘干；对产品进行纯度、丰度检测，纯度＜98.5％可再行重结晶，最终得到15N-L-天冬氨酸产品；15N的摩尔转化率在70％以上，最终15N的利用率达65.99％；等电点母液浓缩后可再调pH或再上柱提纯又可得到产品；对反应残余的15N原料的回收达80％以上。所述的步骤(3)发酵培养以碳源、氮源、微量元素离子配置成发酵培养基，调节其pH值6～8，灭菌后接入大肠杆菌斜面种子，于180～200rpm，25℃～37℃，培养16～24小时。所述的碳源选自葡萄糖、反丁烯二酸、果糖、蔗糖，或含这些糖的糖蜜、淀粉。所述的氮源选自氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵、氨水，或酵母提取物、玉米浆、玉米淀粉中的一种或多种。所述的步骤(3)中，微量元素离子选自磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙中的一种或多种。所述的步骤(3)中，有机氮源玉米浆的添加可通过测定菌体浓度来加以控制，以发酵液稀释10倍后于650nm处测得的吸光度值为0.680作为判断依据。所述的发酵培养基(g/L)玉米浆60，反丁烯二酸20，MgSO4.7H2O 0.2，KH2PO40.5，氨水调pH值5～9，煮沸后过滤。所述的步骤(4)中，底物为反丁烯二酸，底物溶液中所用的15N氮源为15N标记的氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵、氨水、尿素中的一种或多种。所述的步骤(4)中，微量元素离子选自磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙中的一种或多种。本专利技术的技术方法，已建立起一套实验室规模的生产工艺，体现出了酶法制备15N-L-氨基酸的优越性，有利于15N利用率的提高及后提取工艺的简化，减少了生产成本，提高了产品品质，以较高的15N利用率得到丰度下降值很小的产品，且提取得率很高，大大提高了产品的市场竞争力。具体实施例方式本专利技术将通过以下具体实施例来说明本技术的实施过程。实施例1将斜面培养18小时的大肠杆菌接入发酵培养基，500ml三角瓶中装50ml培养基，于30℃恒温摇床培养20小时，转速180rpm。培养所得发酵液于4800rpm离心30分钟，倾去上清液，取得到的湿菌体0.5克加入到底物浓度为10％、含丰度为10.39at％的15N-硫酸铵7.7重量％、0.01重量％的硫酸镁的底物溶液100ml中，用NaOH调节pH值为7.9，于35℃恒温反应23小时。得到的反应液经离心，上清液赶氨浓缩至pH值7.5后，加入活性碳0.2克脱色30分钟后得无色溶液，浓缩至25ml，加入硫酸调至pH值2.85，析出较多晶体，冷却，第二天抽滤、洗涤，得雪白晶体，烘干，得产品9.92克，丰度为10.38at％，仅比原料绝对下降0.01at％，相对下降0.09at％，提取得率为89.3重量％。实施例2取与实施例1一样培养的湿菌体2.0克，加入到底物浓度为11.6重量％，含丰度为99.53at％的15N-氯化铵7.4重量％、0.01重量％的硫酸镁的底物溶液200ml中，用10MNaOH调节pH值为9.0，于39℃恒温反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种稳定同位素标记的［１５］↑Ｎ－Ｌ－天冬氨酸的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下工艺步骤： （１）．发酵产酶所采用的微生物： 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１１３０３或ＣＧＭＣＣ１．８８１； （２）．斜面培养： 培养基为营养肉汁琼脂培养基（ｇ／Ｌ）：蛋白胨１０．０，牛肉膏３．０，氯化钠５．０，琼脂１５．０，蒸馏水１．０Ｌ，ｐＨ值６．８～７．２，定容至１．０Ｌ，分装，０．１ＭＰａ（１２１℃）灭菌２０分钟，菌种接入后２８℃～３２℃培养１６～２４小时； （３）．发酵培养： 以碳源、氮源、微量元素离子配置成发酵培养基，调节其ｐＨ值５～９，灭菌后接入大肠杆菌斜面种子，于１５０～２６０ｒｐｍ，２２℃～４０℃，培养１６～２４小时；装液量为５０ｍｌ／５００ｍｌ，灭菌条件为０．１ＭＰａ（１２１℃），２０分钟； 菌体的生长浓度通过分光光度法加以分析； （４）．酶反应： 底物反应液（ｇ／Ｌ）：底物反丁烯二酸的浓度为５０ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌ，以１００ｇ／Ｌ～１５０ｇ／Ｌ为较佳，加入微量元素离子及［１５］↑Ｎ氮源后用ＮａＯＨ调节ｐＨ值为７．５～９．５； 将发酵所得游离整体细胞作为酶源加入底物溶液中，菌体加入量０．５重量％～１．２重量％，在３０℃～５０℃下，更适宜的３５℃～４０℃反应２０～２８小时，中间经取样以分光光度法测试反丁烯二酸的浓度小于０．２５重量％时停止反应； 反应过程中及最终反应结束时反丁烯二酸的浓度通过紫外分光光度法来测定，从而可计算出转化率； （５）．提取精制及［１５］↑Ｎ的回收： 反应结束后，将酶反应液进行离心，上清液于旋转蒸发仪上赶氨浓缩，所溢出氨加以吸收回收，直至冷凝液ｐＨ值为６．５～７．５；然后将该溶液加热至７５℃～８５℃，加入０．２～０．８重量％活性炭脱色３０～４５分钟，过滤得无色滤液；将滤液置于恒温磁力搅拌器或旋转蒸发仪上加以浓缩至原来体积的１／５～１／３，待温度维持在６０℃～７０℃，加入盐酸等酸调节ｐＨ值至２．８０～３．００，逐渐有晶体析出；冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于５０℃～６０℃真空烘干；对产品进行纯度、丰度检测，纯度＜９８．５％可再行重结晶，最终得到［１５］↑Ｎ－Ｌ－天冬氨酸产品；［１５］↑Ｎ的摩尔转化率在７０％以上，最终［１５］↑Ｎ的利用率...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯静华，周震，李良君，杜晓宁，宋明鸣，
申请(专利权)人：上海化工研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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