本发明专利技术公开了海藻糖合成酶及其编码基因与应用，其目的是提供一种热稳定的海藻糖合成酶及其编码基因与该海藻糖合成酶的表达方法，和利用该海藻糖合成酶生产海藻糖的方法。本发明专利技术所提供的海藻糖合成酶，是具有序列表中的ＳＥＱ ＩＤ №：２的氨基酸残基序列的蛋白质或是将序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：２的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可催化海藻糖合成的蛋白质。本发明专利技术的海藻糖合成酶可以葡萄糖和α－１－磷酸葡萄糖为反应底物，催化合成海藻糖，为工业化酶法生产海藻糖提供了一条新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程和酶工程领域中一种热稳定海藻糖合成酶及其编码基因与应用，特别涉及一种热稳定海藻糖合成酶及其编码基因与该海藻糖合成酶的表达方法，和利用该海藻糖合成酶生产海藻糖的方法。
技术介绍
海藻糖是一种由两个葡萄糖分子以α-1，1糖苷键连接的非还原性双糖，它广泛分布于微生物，植物及昆虫中，通常在环境胁迫条件下海藻糖作为一种相溶性介质对生物大分子乃至生物体起保护作用。研究表明海藻糖是一种有效的保护剂，可以保护酶、活性蛋白、生物膜、医药产品甚至待移植的器官，因此海藻糖生物合成途径的研究和利用已成为目前的研究热点。在微生物中海藻糖主要有三条生物合成途径，即由UDP-葡萄糖和α-葡萄糖-6-磷酸合成海藻糖的OtsA-OtsB途径，由1，4糖苷键连接的寡聚糖在分子内转糖基酶的作用下转变为1，1糖苷键并进而水解生成海藻糖的TreY-TreZ途径，以及由麦芽糖转变为海藻糖的TreS途径。腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)是生活在我国云南省腾冲地区热泉中的一种微生物，是一种嗜热的真细菌，最适生长温度为75℃，厌氧生长，革兰氏染色呈阴性。它是由中国科学院微生物研究所首先发现并进行了分类学上的研究(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.2001，511335-1341)，并已保存在中国微生物保存中心(Thermoanaerobacter tengcongensis AS1.2430T)。该菌的全基因组序列的Genbank保存号为AE008691。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种海藻糖合成酶及其编码基因。本专利技术所提供的海藻糖合成酶，名称为TreP，是一种可催化海藻糖分解和合成可逆反应的磷酸化酶，但其主要功能是催化以1-磷酸葡萄糖和葡萄糖为底物的海藻糖生物合成，其合成效率约是分解效率的70倍以上。该酶来源于腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)，是具有序列表中的SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质或是将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可催化海藻糖合成的蛋白质。序列表中的SEQ ID №2由781个氨基酸残基组成。自序列表中序列2的氨基端第335位-第714位氨基酸残基为糖苷水解酶家族65所具有的保守区。上述海藻糖合成酶的编码基因也属于本专利技术的保护范围。上述海藻糖合成酶的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；3)在高度严谨条件下可与序列表中的序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中的序列1限定的DNA序列具有70％以上的同源性的简并序列。所述高度严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。序列表中的SEQ ID №1由2346个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第2346位碱基。含有本专利技术基因的表达载体、细胞系及工程菌均属于本专利技术的保护范围，如表达载体pTreP，含有pTreP的工程菌-大肠杆菌BL21DE3(pLysS)/pTreP。扩增上述海藻糖合成酶编码基因中任一片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的第二个目的是提供一种表达上述海藻糖合成酶的方法。本专利技术所提供的表达海藻糖合成酶的方法，是将含有上述海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中得到重组宿主细胞，培养所述重组宿主细胞，表达得到海藻糖合成酶。用于培养所述重组细胞的培养基可为培养宿主细胞的培养基，并添加载体要求的抗生素(如pTreP对应的氨苄青霉素等)。在本专利技术中，可选用本领域已知的各种载体，如市场销售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等作为出发载体。可以将上述海藻糖合成酶编码基因直接地连接于表达载体中表达调控序列下游，从而形成含有上述海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体。所述表达载体含有复制起始点和表达调控序列，启动子，还可能含有增强子和必要的加工信息位点。表达载体还必须含有可供选择的标记基因，如具有抗生素或其它毒性物质(氨苄青霉素，卡那霉素，氨甲蝶呤等)抗性的蛋白质的编码基因，或互补营养缺陷型的蛋白质的编码基因或提供复合培养基中没有的必需营养成分的蛋白质的编码基因。各种不同宿主的合适标记基因是本领域中所熟知或生产厂商说明书注明的。这些重组表达载体可以用本领域技术人员所公知的重组DNA技术制备，如可参考Sambrook等人的做法(分子克隆实验指南1989)等。所述重组表达载体可为pTreP。可根据具体采用的重组表达载体选择相应的表达条件。所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。常用的原核细胞包括大肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核细胞包括酵母细胞和各种动植物细胞。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，所述重组宿主细胞可为含有pTreP的工程菌-大肠杆菌BL21DE3(pLysS)/pTreP细胞。重组表达载体可以用本领域熟知的方法引入宿主细胞，这些方法包括电转化法，氯化钙法，基因枪法等。表达的蛋白可通过本领域所熟知的蛋白分离技术，如柱层析等得到所需纯度的蛋白质。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如柱层析，PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。本专利技术的第三个目的是提供一种生产海藻糖的方法。本专利技术所提供的生产海藻糖的方法，是以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为反应底物，利用上述海藻糖合成酶催化合成海藻糖。所述葡萄糖、α-1-磷酸葡萄糖与所述海藻糖合成酶的摩尔比可为3-5∶1∶10-5，优选为3∶1∶10-5。所述海藻糖合成酶催化合成海藻糖的适宜催化pH范围为5.5-6.5，适宜催化温度范围为60-70℃。所述葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖可由廉价的淀粉或蔗糖经葡萄糖基磷酸化酶催化得到。实验证明，本专利技术的海藻糖合成酶可以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为反应底物，催化合成海藻糖，还可以催化海藻糖分解为葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖，但其主要功能是催化海藻糖合成反应。本专利技术的海藻糖合成酶催化合成海藻糖的最适pH为6.0，最适温度为70℃。热稳定性实验表明，该酶性质比较稳定，在70℃下温育5小时还能保持80％以上的活性，是一个新的热稳定海藻糖合成酶。该酶为工业化酶法生产海藻糖提供了一条新的途径。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。附图说明图1为海藻糖合成酶表达工程菌BL21DE3(pLysS)/pTreP的构建示意2为大肠杆菌中表达的TreP的SDS-PAGE电泳图谱图3A为海藻糖合成酶催化的海藻糖合成反应开始时(0min)和反应30min后(30min)的HPLC图谱图3B为海藻糖合成酶催化的海藻糖分解反应开始时(0min)和反应30min后(30min)的HPLC图谱图4A为海藻糖合成酶催化海藻糖分解反应的pH-稳定性曲线图4B为海藻糖合成酶催化海藻糖合成反应的pH-稳定性曲线图4C为海藻糖合成酶催化海藻糖分解反应的温度-稳定性曲线图4D为海藻糖合成酶催化海藻糖合成反应的温度-稳定性曲线图5为海藻糖合成酶催化海藻糖合成反应的热稳定性曲线具体实施方式本文档来自技高网...
【技术保护点】
海藻糖合成酶，是具有序列表中的ＳＥＱＩＤ№：２的氨基酸残基序列的蛋白质或是将序列表中ＳＥＱＩＤ№：２的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可催化海藻糖合成的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：向华，任媛媛，刘景芳，周坚，谭华荣，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。