具有血管保护效应的栉孔扇贝糖胺聚糖的提取方法技术

本发明专利技术涉及一种具有血管保护效应的活性物质－栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，其提取制备工艺如下：将栉孔扇贝内脏团称重，加水制成匀浆液，在匀浆液中加入蛋白酶，加热反应得酶解液；将酶解液在离心机中离心，弃去沉淀物，对离心液加二次乙醇溶液，形成沉淀；将分离后的沉淀物加蒸馏水配成水溶液后加热并加入活性炭，冷却后经离心，收集上清液，对上清液抽滤，得清液；将清液用滤膜超滤，得分子量为５ｋ～１００ｋ的滤液；将滤液冷冻干燥即制得栉孔扇贝糖胺聚糖。该方法操作简单、反应条件温和、成本低廉、得率及纯度高，在提取糖胺聚糖的同时还可大量回收蛋白质，有利于栉孔扇贝内脏团的综合利用，提取的物质对于防治心脏血管性疾病有重要价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从栉孔扇贝内脏团中提取制备具有血管保护效应的活性物质——栉孔扇贝糖胺聚糖(SS-GAG)的方法，属于对海产品扇贝进一步综合加工利用的技术方法。
技术介绍
近年来扇贝养殖在我国发展迅速，主要有栉孔扇贝、海湾扇贝等品种。扇贝在加工后所得的下脚料——扇贝内脏团(也称扇贝裙边)大部分被丢弃，造成极大浪费，大量扇贝裙边资源函待开发利用。已知扇贝内脏团中含有多种成分，其中糖胺聚糖(GAG)是十分重要的活性物质。据国内外文献报道，海洋软体动物中含有多种GAG，如刺参、海星、鲨鱼、翡翠贻贝、马氏珠母贝等动物中的GAG，分别具有抗凝、降脂、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等生物活性。已引起人们对这类高分子活性物质的高度重视。有文献报道，从海湾扇贝的净边中提取出一种肝素样的GAG，具有抗凝活性。对于从栉孔扇贝内脏团中提取有血管保护效应的GAG的方法国内外未见有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供一种从栉孔扇贝内脏团中提取制备具有保护血管效应的物质——栉孔扇贝糖胺聚糖的方法，所提取的糖胺聚糖之理化特征是呈微黄色粉末状，无臭无味、易潮解、易溶于水；为类肝素样氨基多糖，所含的氨基己糖主要为氨基半乳糖，己糖醛酸以艾杜糖醛酸为主；其硫酸基与羧酸基的比值为1.69∶1；所设计的制备方法，具有操作简单、反应条件温和、成本低廉、得率及纯度高、工艺有利于综合利用的特点。本专利技术涉及的，是以近海养殖的栉孔扇贝内脏团为原料而制得，提取制备工艺如下将鲜品或冻品解冻后的栉孔扇贝内脏团称重，加水制成匀浆液，控制室温8～32℃，在匀浆液中加入蛋白酶，加热搅拌，反应4～5小时，得酶解液；将酶解液在离心机中离心，得离心液，弃去沉淀物；对离心液加二次乙醇溶液，形成沉淀，用离心机分离，得沉淀物，回收上清液乙醇；对沉淀物加蒸馏水配成水溶液后加热并加入活性炭搅拌，冷却后经离心，收集上清液，弃去沉，淀；对上清液抽滤，进一步除去活性炭及其吸附的蛋白质及色素，得清液；将清液用滤膜超滤，得分子量为5k～100k的滤液；将滤液冷冻干燥，即制得浅黄色粉末状精制栉孔扇贝糖胺聚糖。本，在匀浆液中加入的蛋白酶为中性蛋白酶和胰蛋白酶，中性蛋白酶加入量为15～20g/kg匀浆液，胰蛋白酶加入量为5～10g/kg匀浆液中，反应温度为50℃，时间为4～5小时。本，对离心液加2次乙醇溶液时，其加入的乙醇溶液浓度为90～95％，其终浓度为65～75％，反应时间为12小时。本，所述的对沉淀物加蒸馏水配成水溶液时，制得的水溶液浓度为4～6％。本，所述的对水溶液加热加活性炭，其活性炭加入量是活性炭重量与水溶液体积比为1～2％，其加热温度为80℃。本的提取制备方法，所述的将清液超滤，其超滤先后应用100k和5k滤膜，最终得分子量为5k～100k的滤液。本专利技术的制备方法，其优点之一在于该方法促进了栉孔扇贝的综合利用，以往栉孔扇贝加工扇贝柱后剩余的内脏团作为废料大部分被丢弃，而本制备方法是利用废弃物提取有药用价值的糖胺聚糖，其成本低廉，而且这种栉孔扇贝糖胺聚糖具有的血管保护效应是首次被发现证实。在提取糖胺聚糖的同时还可大量回收蛋白质，增加了其经济效益及药用价值。本方法优点之二是提取方法简单、得率及纯度高。该方法采用中性蛋白酶和胰蛋白酶进行水解，较一种蛋白酶或胰匀浆水解更充分。该方法在栉孔扇贝内脏团匀浆液里直接加入蛋白酶进行水解，比起文献中提取多糖常用的先加丙酮脱脂制成丙酮粉，然后再进行酶解简单的多。具体实施例方式实施例1称取新鲜栉孔扇贝内脏团2kg，在室温20℃条件下加水2升制成匀浆液，取匀浆液加入中性蛋白酶35g，胰蛋白酶10g，在50℃条件下电动搅拌5小时得酶解液；用5000转/分离心约四十分钟；取离心液，弃去沉淀物；对离心液加入95％乙醇，乙醇终浓度为70％，经搅拌后静置12小时，经6000转/分离心30分钟，得沉淀物，再加一次95％的乙醇溶液洗涤，6000/分离心30分钟，回收上清液(乙醇)，收集湿的沉淀物约85g；将沉淀物用蒸馏水配成5％溶液1700ml，加热至80℃，加入活性炭17g，搅拌30分钟；冷却后离心(6000转/分)30分钟，收集上清液，弃去沉淀；上清液经沙心漏斗抽滤，进一步去除活性炭及其吸附的蛋白质及色素，得清液；将清液用100k滤膜超滤，得滤过液体，再用5k滤膜继续超滤，得滤不过液体(分子量5k～100k)，经冷冻干燥，即得浅黄色粉末状的精制栉孔扇贝糖胺聚糖4.5g。实施例2取已解冻的栉孔扇贝内脏团2kg，按实施例1方法提取制备栉孔扇贝糖胺聚糖，最终得4.0g栉孔扇贝糖胺聚糖。实施例3按实施例1方法分不同时间、不同原料量提取制备栉孔扇贝糖胺聚糖，具体结果见表1。 表1对提取制备的栉孔扇贝糖胺聚糖进行了多项药效学实验，结果表明用本专利技术方法提取得到的栉孔扇贝糖胺聚糖对血管平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用，对泡沫细胞形成有明显的抑制作用，对人血管内皮细胞损伤具有明显的保护作用。下面简要说明，作为对本专利技术效果的进一步证明。(一)栉孔扇贝糖胺聚糖对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用血管平滑肌细胞(VSMCs)的移行与过度增生是动脉粥样硬化最基本的病理改变，也是冠脉成型术后再狭窄的主要原因。本实验观察了栉孔扇贝糖胺聚糖对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用以及对血管平滑肌细胞的合成分泌功能的影响。1.栉孔扇贝糖胺聚糖对血管平滑肌细胞增殖活性的影响分别取家兔和大鼠的胸主动脉，采用胶原酶消化法和组织块贴壁法进行血管平滑肌细胞原代培养，待细胞贴壁、融合并长成致密单层后进行传代培养，取5-8代细胞进行实验。观察研究了栉孔扇贝糖胺聚糖对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管平滑肌细胞增殖活性的作用、对20％胎牛血清(FBS)诱导的血管平滑肌细胞增殖活性的作用、对血管平滑肌细胞的血小板衍化生长因子(PDGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响、对血管平滑肌细胞增殖动力学的影响。实验结果表明，栉孔扇贝糖胺聚糖在50、100、200μg·mL-1浓度下，对20％FBS、bFGF所致的血管平滑肌细胞增殖均有明显抑制作用，并能逆转血管平滑肌细胞增殖时PCNA、PDGF的表达增强。栉孔扇贝糖胺聚糖可通过抑制血管平滑肌细胞S期的DNA合成、减少S期细胞从而阻抑血管平滑肌细胞的增殖。2.栉孔扇贝糖胺聚糖对增殖的血管平滑肌细胞抗氧化功能的影响建立碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管平滑肌细胞增殖模型，采用酶法和硫代巴比妥酸法等方法测定各组细胞的培养液中SOD超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性、丙二醛含量及总抗氧化能力的变化，观察不同浓度栉孔扇贝糖胺聚糖对增殖的血管平滑肌细胞的抗氧化功能的影响。实验结果表明，栉孔扇贝糖胺聚糖(100ug/ml、200ug/ml)可增强血管平滑肌细胞的总抗氧化能力和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，减少过氧化物丙二醛的产生，提高细胞的抗氧化功能。3、栉孔扇贝糖胺聚糖对增殖的血管平滑肌细胞内一氧化氮合酶(NOS)及一氧化氮(NO)含量的影响建立bFGF诱导的家兔血管平滑肌细胞增殖模型。采用硝酸还原酶法测定细胞内一氧化氮(NO)的含量，用比色法测定细胞内一氧化氮合酶(NOS)活力。实验结果表明，栉孔扇贝糖胺聚糖能够提高血管平滑肌细胞内NO的含量和NOS活性。4、栉孔本文档来自技高网...

【技术保护点】
栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，其特征在于其提取制备工艺如下：将鲜品或冻品解冻后的栉孔扇贝内脏团称重，加水制成匀浆液，控制室温８～３２℃，在匀浆液中加入蛋白酶，加热搅拌，反应４～５小时，得酶解液；将酶解液在离心机中离心，得离心液，弃去沉淀物；对离心液加二次乙醇溶液，形成沉淀，用离心机分离，得沉淀物，回收上清液乙醇；对沉淀物加蒸馏水配成水溶液后加热并加入活性炭搅拌，冷却后经离心，收集上清液，弃去沉淀；对上清液抽滤，进一步除去活性炭及其吸附的蛋白质及色素，得清液；将清液用滤膜超滤，得分子量为５ｋ～１００ｋ的滤液；将滤液冷冻干燥，即制得浅黄色粉末状精制栉孔扇贝糖胺聚糖。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘赛，刘晨光，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]