具有反馈抗性的甲羟戊酸激酶制造技术

本发明专利技术涉及经过修饰的甲羟戊酸激酶，其对于反馈抑制具有更小的敏感度，还涉及能编码它们的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包含这些多核苷酸的载体以及包含这些载体的宿主细胞。本发明专利技术提供了一种用于生产经修饰的酶的方法以及用于生产类异戊二烯化合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了经过修饰的甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase)，其对于反馈抑制具有更小的敏感度。该经过修饰的酶和编码该酶的多核苷酸可被用于生产类异戊二烯(isoprenoid)化合物，用于治疗具有甲羟戊酸激酶活性降低的特征的疾病，以及用于诊断用途。甲羟戊酸激酶(MK)是甲羟戊酸途径中必需的酶，所述途径导致了大量细胞内类异戊二烯的产生。类异戊二烯途径的产物异戊烯二磷酸(IPP)，以及同质异构化合物，二甲基烯丙基二磷酸(DAMPP)是所有生物中类异戊二烯的基本构建物质。类异戊二烯包括超过23000种天然存在的初级和次级代谢物分子。该类天然产物的化学多样性反映了它们在生物系统中多种多样的生理作用。类异戊二烯包括，例如细菌中的植烷三萜、泛醌和甲基萘醌，植物中的类胡萝卜素、质体醌、单/一个半/双/三萜以及叶绿素的含异戊二烯基侧链，和哺乳动物中的血红素A、醌、多萜醇、固醇/类固醇和类维生素A。此外，类异戊二烯还涉及异戊烯tRNA、蛋白质异戊烯化以及胆固醇修饰，例如对刺猬类细胞信号蛋白质进行的。人们已在多种生物中于生物化学及分子水平上对MK酶进行了分析(Houten et al.，Biochim.Biophys.Acta 1529，19-32，2000)。目前，很多甲羟戊酸激酶的DNA和氨基酸序列都是已知的(例如，Swiss-Prot编号/IDsP07277/kime_yeast；Q9R008/kime_mouse；P17256/kime_rat；Q03426/kime_human；P46086/kime_arath；Q09780/kime_schpo；Q9V187/kime_pyrab；059291/kime_pyrho；Q8UOF3/kime_pyrfu；Q50559/kime_metth；027995/kime_arcfu；Q58487/kime_metia；Q9Y946/kime_aerpe)，并且，每个月还会有一些序列被增加到已知甲羟戊酸激酶序列的列表中。基于其与已知甲羟戊酸激酶序列的相似性，上述从基因组测序计划中获得的序列已被赋予了假定的甲羟戊酸激酶功能。但是，对本领域的技术人员而言，很容易证明这些序列事实上能编码具有甲羟戊酸激酶活性的蛋白质。在调控的方面，人们普遍认为HMG-CoA还原酶是甲羟戊酸途径中的速度决定酶(例如，Goldstein and Brown，Nature 343，425-430，1990；Weinberger，Trends Endocrinol.Metab.7，1-6，1996；Hampton et al.，TrendsBiochem.Sci.21，140-145，1996；Houten et al.，J.Biol.Chem.278，5736-5743，2003)。与该观点一致的是，向培养基中添加甲羟戊酸已显示出能激活Phaffia rhodozyma(Calo et al.，Biotechnol.Lett.17，575-578，1995)和Haematococcus pluvialis(Kobayashi et al.，J.Ferment.Bioeng.71，335-339，1991)中的类胡萝卜素生产。但是，近年来更多的证据显示，甲羟戊酸激酶会受到反馈抑制，例如下游产物，牻牛基二磷酸(geranyldiphosphate)、法呢基二磷酸(farnesyldiphosphate)、双牻牛基二磷酸(geranylgeranyldiphosphate)所造成的。这种反馈抑制还可在对甲羟戊酸途径的调控和速度限制中发挥作用，因此，通常对类异戊二烯的生物合成的调控和速度限制发挥作用。在人类中，甲羟戊酸激酶的缺乏被鉴定为下述人类遗传疾病的生物化学和分子诱因，从而显示出其重要性，所述疾病包括甲羟戊酸尿症、超免疫球蛋白D症以及周期性发热综合征(Houten et al.，2000；Nwokoro et al.，Mol.Genet.metab.74，105-119，2001)。上述疾病的病理尚属未知，但最终将发现其与甲羟戊酸激酶在体内的作用以及与急相反应和发热有关的类异戊二烯生物合成有关。甲羟戊酸激酶缺乏看上去还与(例如)Zellweger综合征和肢近端型点状软骨发育不良(rhizomelic chondrodysplasia punctata)有关，这是过氧化物酶生物合成紊乱的疾病，其中，一组过氧化物酶，包括甲羟戊酸激酶，不能被转运到过氧化物酶体中(Kelley and Herman，Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2，299-341，2001)。最后，甲羟戊酸激酶被认为在细胞内增殖、细胞周期调控和/或细胞内转化中发挥作用(见Graef et al.，virology 208，696-703，1995；Hinson et al.，J.Biol.Chem.272，26756-26760.1997)。目前研究的所有甲羟戊酸激酶都会受所述途径下游产物的反馈抑制。目前还没有报道过对反馈抑制具有抗性的甲羟戊酸激酶，例如，法呢基二磷酸或双牻牛基二磷酸造成的反馈抑制。对反馈具有抗性的甲羟戊酸激酶可能具有工业潜力，例如(1)在用生物技术对所有类型的类异戊二烯化合物(例如，类胡萝卜素、辅酶Q10、维生素D、固醇等)进行的生产中，(2)作为具有诊断用处的酶，用于，例如，用酶测量生物流体中的甲羟戊酸浓度，或(3)作为治疗用酶，用于降低甲羟戊酸尿症病患的甲羟戊酸浓度。对反馈具有抗性的MK特别适于对类异戊二烯进行生物技术途径的生产，因为它们能使得甲羟戊酸途径具有更大的通量，因此使得类异戊二烯产量更高。本文中使用的术语“甲羟戊酸激酶”将表示任何能够催化甲羟戊酸酯(甲羟戊酸)磷酸化反应的酶，所述反应包括甲羟戊酸酯(甲羟戊酸)向5-磷酸甲羟戊酸酯(5-磷酸甲羟戊酸)的转化，或甲羟戊酸类似物(例如，Wilde and Eggerer，Eur.J.Biochem.221，463-473，1994所述的)向其相应的磷酸化化合物的转化。为提供对甲羟戊酸(或甲羟戊酸类似物)的磷酸化，该酶额外需要合适的磷酸供体。不同的化合物都可作为用于甲羟戊酸激酶的磷酸供体。最优选的磷酸供体是ATP(5’-三磷酸腺苷)。其它优选的磷酸供体是TTP、ITP、GTP、UTP或CTP(见Gibson et al.，Enzyme41，47-55，1989)。“甲羟戊酸激酶”可以是与SEQ ID NO1至14所示的氨基酸序列中的一种或多种同源的。“同源的”指与SEQ ID NO1至14和30所示的氨基酸序列中的一种或多种至少约60％相同，优选至少70％相同，更优选至少约80％相同，进一步更优选至少约90％相同，最优选至少约95％相同。本领域已知的术语“％相同”表示多肽或多核苷酸序列间的相关程度，这可以是通过对上述序列排列起来达成的匹配程度进行测定得到的。用已知的方法可对“相同性”很容易的进行测定，例如用程序GAP(GCGWisconsin Package，version 10.2，Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，SanDiego，CA 92121-3752，USA)来进行，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经过修饰的甲羟戊酸激酶，其展示出的对反馈抑制的敏感性较之相应的未经修饰的甲羟戊酸激酶要低，其中　　　　（ｉ）较之相应的未经修饰的甲羟戊酸激酶的氨基酸序列，经过修饰的甲羟戊酸激酶的氨基酸序列含有至少一处突变，并且　　　　（ｉｉ）所述至少一处突变发生于选自由如下氨基酸位置所构成的组中的氨基酸位置中的一处或多处，所述氨基酸位置相应于如ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１所示的Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　　ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ甲羟戊酸激酶的氨基酸序列上的１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、１６９、２０４和２６６位。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：白仁羽楠，马卡斯哈波林，马丁莱玛恩，如尔罗帕斯乌里巴瑞，马卡斯维斯，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]