半固体筛选培养基及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种半固体筛选培养基及其制备方法和应用。该半固体筛选培养基包括如下体积份数的组分：0.8～1.5份100×Eu3+微球标记的抗原溶液；0.05～0.15份1000×EGF溶液；0.05～0.15份1000×IL‑6溶液；0.5～1份100×青霉素和链霉素的双抗溶液；0.5～1份100×B细胞刺激因子溶液；2～4份50×HAT溶液；18～25份胎牛血清；65～80份甲基纤维素半固体培养基。本发明专利技术提供的半固体筛选培养基是具有时间分辨荧光特性的，在筛选杂交瘤细胞时，大大缩短筛选所需的时间，极大降低背景荧光的假阳性，使得筛选成功率大大提高。

Semisolid screening medium and its preparation methods and Applications

【技术实现步骤摘要】
半固体筛选培养基及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种半固体筛选培养基及其制备方法和应用，具体为一种时间分辨荧光半固体筛选培养基及其制备方法和应用。
技术介绍
时间分辨荧光分析法(Timeresolvedfluoroisnmunoassay，TRFIA)是上世纪80年代提出的一种较为新型的检测手段，是以具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合剂作为示踪物，建立的一种新型的非放射性微量分析技术。TRFIA是根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。由于其高灵敏度，在临床上得到了广泛的应用，逐渐代替了放射免疫分析。单克隆抗体技术的基本原理是将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养的骨髓瘤细胞进行杂交，筛选得到的杂交瘤细胞既能分泌抗体又有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，由一个杂交瘤细胞繁殖、分泌的抗体称为单克隆抗体，它只针对一个抗原表位。细胞融合时，B细胞是从抗原免疫的动物的脾脏中分离出来的，骨髓瘤细胞是经过诱变和筛选得到的缺陷型，其本身不能分泌抗体；并且是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷型，不能在含有次黄嘌呤(hypoxanthineH)、氨基蝶呤(aminopterin,A)、胸腺嘧啶(thymidineT)的筛选培养基(HAT)中存活，HAT系次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。在融合后的细胞群中，未融合的脾细胞和相互融合的脾细胞，不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的骨髓瘤细胞和融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活下来，所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。一个脾脏中，能分泌抗体的细胞占的比例很少，90％以上的细胞是不能分泌抗体的。即使进行了人工免疫，能分泌出针对人工免疫的抗原的抗体的细胞比例也是很低的，并且两个细胞的融合是随机的，因此，尽管一个成功免疫的脾脏可达到2×108个细胞以上，但细胞融合后能得到目标杂交瘤的数量也是很有限的，如何筛选克隆出这些能分泌目的抗体的杂交瘤细胞是一个非常关键的问题。传统的单抗生产过程中，细胞融合后的有价值细胞株的筛选非常繁琐，首先ELISA检测，检测到有价值的细胞孔，此时该孔内的细胞不是单克隆细胞株，为了得到单克隆细胞株需要对该孔的细胞利用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后细胞长起来再用ELISA进行检测得到阳性的细胞孔，再对阳性孔进行亚克隆，再ELISA检测，直到最终得到的细胞是由一个细胞繁殖而来的单克隆株。这个过程耗时、耗力、耗材特别严重，一次亚克隆周期要15天，且整个流程由于太繁琐，使细胞培养过程中容易污染，使整个单克隆制备过程失败。杂交瘤细胞的克隆化是单克隆抗体制备过程中工作量最大的部分，实验室传统的克隆化方法为有限稀释法，该法需要多次进行有限稀释获得单克隆杂交瘤，耗时较长，在克隆化之前一些不分泌抗体的杂交瘤往往生长很快，影响分泌抗体的杂交瘤细胞的生长易导致阳性克隆丢失，筛选效率较低。除了有限稀释法，目前也有应用HAT半固体培养基筛选克隆化细胞的方法，但目前的HAT半固体培养基存在以下几个问题：1.目前的半固体培养基筛选过程中并不能保证产生的克隆是由单细胞而来；2.目前的半固体培养基筛选过程中用荧光素标记抗原筛选的方法虽然一定程度上提高了筛选效率，缩短了筛选时间，但是其中细胞、尤其是克隆化后的细胞其自身荧光背景会对筛选造成很大干扰，易造成假阳性，使筛选效率大大降低。因此需要开发一种筛选周期短、筛选效率高、假阳性率低的筛选培养基。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种具有时间分辨荧光特性的半固体筛选培养基，该半固体筛选培养基能大大缩短筛选时间，极大降低背景荧光的假阳性，使得筛选成功率大大提高。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：半固体筛选培养基，包括如下体积份数的组分：本专利技术的半固体筛选培养基，使整个亚克隆和筛选过程变的简单快捷。融合完的细胞不再如传统的方法用液体培养基来种96孔培养板，而是直接种在本专利技术的半固体筛选培养基中，等融合后的细胞开始生长10天左右形成200细胞左右的克隆团，因为半固体培养基非常粘稠，长成的克隆团不会扩散开，种前计算好密度克隆团之间都有明显的距离，所以克隆团之间没有交叉混合。由于在半固体筛选培养基中加入了含有针对特异性抗体的、带时间分辨荧光微球的抗原，因而在这种培养条件下，分泌抗体的细胞表面能结合特异性的抗原。在时间分辨荧光仪下，用365nm波长的激发光激发，在200-300ms后用615nm波长下观察，有红色荧光的即为分泌针对目标抗原抗体的阳性融合细胞，在镜下将这些细胞可控标记好后，再在解剖镜下用无菌的移液器把每个克隆团分别挑到96孔板的孔中，使其进一步生长，然后ELISA检测，阳性的孔就是单克隆细胞株，即筛选和亚克隆用该专利技术的半固体筛选培养基一步就能完成。使单抗生产的工艺变的相对简单快捷，且避免了由于细胞克隆团本身带有的自发荧光造成的假阳性。进一步，所述Eu3+微球标记的抗原溶液中Eu3+微球与抗原的质量比为：0.02～1：1。所述抗原溶液中抗原为能偶联Eu3+荧光微球的可溶性蛋白。本专利技术Eu3+微球与抗原的比例有助于形成抗原微球，微球表面充分包被上抗原，同时降低未被抗原包被的微球造成的假阳性，从而提高筛选的灵敏度。所述Eu3+微球为Eu3+纳米荧光微球，Eu是稀土元素铕，Eu3+是铕离子，稀土元素可以由电磁辐射激发产生光。所述Eu3+微球标记的抗原溶液的制备方法为：将Eu3+纳米荧光微球溶于0.01MpH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×1012个/mL，400w超声处理30秒，然后缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺(EDC)，室温匀速搅拌温育15min后，150000g离心10分钟，收集沉淀，用0.01MpH8.0的硼酸缓冲液反复洗涤离心2次即得活化的荧光微球。将活化的荧光微球复溶于0.01MpH8.0的硼酸缓冲液中，加入可溶性抗原溶液，4℃搅拌反应12h后，12000g离心10分钟，收集沉淀，复溶于含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白的0.01MpH7.4的磷酸缓冲液中，即得荧光微球标记的可溶性抗原，置于4℃保存备用。Eu3+荧光微球可商品化购买，也可以自行包被，商品化的荧光微球粒径为0.2μm，购自于ThermoFisherScientific，商品名为Fluoro-MaxCarboxylate-ModifiedandStreptavidin-CoatedEuropiumChelateParticles。在制备杂交瘤细胞时，细胞融合过程中会受到PEG(聚乙二醇)的损伤，且细胞融合后种植密度较低，加入EGF(EpidermalGrowthFactor，表皮生长因子)和IL-6(Interleukin6，白介素6)能促进细胞的生长。进一步，所述的半固体筛选培养基，包括如下体积份数的组分：作为一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
半固体筛选培养基，其特征在于，包括如下体积份数的组分：

【技术特征摘要】
1.半固体筛选培养基，其特征在于，包括如下体积份数的组分：2.根据权利要求1所述的半固体筛选培养基，其特征在于，所述Eu3+微球标记的抗原溶液中Eu3+微球与抗原的质量比为0.02～1：1。3.根据权利要求1所述的半固体筛选培养基，其特征在于，包括如下体积份数的组分：4.根据权利要求1所述的半固体筛选培养基，其特征在于，所述甲基纤维素半固体培养基由按照体积比为1：1的2×DMEM培养基和4％的甲基纤维溶液充分混匀得到。5.权利1-4任一项所述的半固体筛选培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)按上述体积比配置甲基纤维素半固体培养基；2)按上述体积比将50×HAT溶液、胎牛血清、100×青霉素和链霉素的双抗溶液、1000×EGF溶液、1000×IL-6溶液混合均匀、100×B细胞刺激因子溶液和100×Eu3+微球标记的抗原溶液混合均匀，得混合物；3)将步骤1所述甲基纤维素半固体培养基与步骤2)所述混合物混合均匀得半固体筛选培养基。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)混合的温度为4℃，混合的时间为6～24h；步骤3)中混合的温度为4℃。7.权利1...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹杰，
申请(专利权)人：成都微康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51