阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法技术

本发明专利技术涉及阳离子脂质体非病毒基因载体领域，具体涉及阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法。本发明专利技术通过琼脂糖凝胶电泳技术定性定量的分析阳离子脂质体与基因的解离过程；通过在复合物中加入荧光染料，建立荧光共振能量转移体系，采用荧光光谱技术及停流光谱技术检测阳离子脂质体与基因在细胞外及细胞内的解离过程，拟合其解离动力学曲线符合非线性方程。本发明专利技术公开的阳离子脂质体/基因复合物解离动力学的检测方法，适用于研究带正电荷的阳离子脂质体/基因复合物细胞外及细胞内解离动力学过程，拓宽了琼脂糖凝胶电泳技术、荧光光谱技术和停流光谱技术的应用，并为阳离子脂质体介导基因递送机制研究及进一步应用研究提供理论基础。

Determination of cationic liposome / gene complex dissociation kinetics

The present invention relates to the field of cationic liposome non - viral gene carrier, and specifically relates to the method for detecting the dissociation kinetics of cationic liposome / gene complex. The present invention through the dissociation process of cationic liposome gene analysis and agarose gel electrophoresis of qualitative and quantitative; the fluorescent dye is added in the composites, a fluorescence resonance energy transfer system, by using fluorescence spectroscopy and stopped flow spectroscopy to detect dissociation process of cationic lipid body and gene in the extracellular and intracellular, consistent with nonlinear equations the dissociation kinetics curve fitting. Detection method of cationic liposome / disclosed kinetic dissociation gene complexes, application of cationic lipid on the positively charged body / gene complexes of extracellular and intracellular dissociation kinetics, broaden the application of agarose gel electrophoresis, fluorescence spectroscopy and stopped flow spectroscopy, and provide a theoretical basis for the cation liposome mediated gene delivery mechanism research and further application research.

【技术实现步骤摘要】
阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法
本专利技术涉及阳离子脂质体非病毒基因载体领域，具体涉及阳离子脂质体/基因复合物解离动力学的检测方法。
技术介绍
基因治疗是通过载体向靶细胞或组织引入外源正常基因片段(DNA或RNA)，关闭或抑制异常基因的表达，以治疗因基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗要得到进一步的发展，必须克服三个方面的难题：一、要有用于治疗的目的基因和接受目的基因的细胞；二、实现基因表达的可调控性；三、获得具有靶向性的高效的基因载体系统。阳离子脂质体是目前研究最深入、应用最广泛的一种基因递送载体，其介导基因体外递送过程主要分为：阳离子脂质体与基因通过静电作用相结合，形成阳离子脂质体/基因复合物；带正电的复合物通过静电作用吸附于带负电的细胞表面，然后通过内吞作用或者与细胞膜融合而进入靶细胞，形成内涵体；在细胞内，内涵体膜破坏并释放基因，基因被进一步递送到细胞核内，经转录和翻译，最终产生目的基因编码的蛋白质，使转染基因得以表达。在这个过程中，阳离子脂质体/基因复合物进入细胞后，不是所有的基因都能表达，基因必须从复合物中释放，才能发挥它们的作用。因此，基因从复合物中的释放则是基因被宿主转录机制识别而发挥作用的前提条件。对于阳离子脂质体/基因复合物解离动力学的研究，国内外相关报道甚少。刘瑞珍[1]等采用[Ru(phen)2dppz]2+作为探针研究阳离子脂质体/基因复合物、壳聚糖/基因复合物的解离动力学，但是只研究了N/P比例为0.5:1～4:1的复合物的解离过程，只跟踪了复合物在0～6s内的解离过程。国内外尚缺少通过动力学技术对阳离子脂质体/基因复合物宏观时间及微观时间下解离过程的研究，严重制约阳离子脂质体的发展。另一方面，凝胶电泳作为一种高分辨、高灵敏、高速度、高通量及低样品消耗的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。其不仅可以很直观地观察到基因从阳离子脂质体/基因复合物中释放情况，而且可以定量的分析基因从复合物中释放的量。目前，对于凝胶电泳在解离动力学方面的应用还未有报道。再一方面，FRET是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体)的发射光谱与另一个基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于10nm)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。目前，对于荧光光谱法在阳离子脂质体/基因复合物解离动力学方面的研究还未见报道。
技术实现思路
为了研究阳离子脂质体/基因复合物解离动力学问题，阐明阳离子脂质体介导基因递送机制提供理论依据，本专利技术提供检测阳离子脂质体/基因复合物解离动力学的方法，通过琼脂糖凝胶电泳技术直观且定量的分析不同时间阳离子脂质体与基因解离情况。通过构建荧光共振能量转移体系，采用荧光光谱仪和停流光谱仪分别从宏观尺度及微观尺度进行阳离子脂质体/基因复合物解离动力学分析，计算基因从阳离子脂质体/基因复合物中不同时间内的释放量，拟合其解离动力学方程。本专利技术采用如下技术方案，阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法，具体步骤如下：(1)阳离子脂质体与基因按照质量比(N/P)6：1～1：1制备阳离子脂质体/基因复合物，加入浓度为0.02-2μg/μL竞争性结合剂与基因竞争性结合阳离子脂质体，使基因从复合物中释放，采用琼脂糖凝胶电泳检测阳离子脂质体/基因复合物解离0～48h基因从复合物中的释放情况，采用凝胶成像系统软件定量分析阳离子脂质体解离基因的量；(2)根据步骤(1)制备阳离子脂质体/基因复合物，加入荧光染料与阳离子脂质体竞争性结合基因，建立荧光共振能量转移体系，使基因从复合物中解离，荧光染料与基因的质量比1:1～24:1，解离0～48h，采用荧光光谱测量基因从复合物释放不同时间后的发光强度；采用停流光谱仪检测0-200s内基因从复合物中瞬时释放动力学，得到解离动力学曲线，通过停流光谱仪分析软件进行线性拟合，得到结合动力学轨迹符合线性方程；y＝0.1027ln(x)+0.9015，其中x代表结合时间，y代表结合后荧光变化，用电压表示；(3)利用透射电子显微镜检测阳离子脂质体/基因复合物的细胞内解离过程：培养肿瘤细胞种植于6孔细胞培养板中，使其在转染日细胞密度达80～90％；根据步骤(1)制备阳离子脂质体/基因复合物，加到细胞培养板中，培育0h～96h，将肿瘤细胞制成细胞悬液，加入戊二醛固定24h，经树脂包埋后进行细胞超薄切片，再经醋酸双氧铀染色后，在透射电镜下观察基因在肿瘤细胞内的释放情况，透射电镜加速电压为100kV。所述步骤(2)中发光强度的检测条件为：激发波长260nm，发射波长600nm，激发狭缝为1nm，发射狭缝为0.8nm，扫描范围为550-750nm。所述停流光谱仪检测条件为：激发波长260nm，发射波长600nm，仪器恒温25℃。所述阳离子脂质体为氨基酸型阳离子脂质体、肽型阳离子脂质体、单价季铵盐阳离子脂质体和双子型季铵盐阳离子脂质体。所述基因包括质粒DNA、siRNA。所述荧光染料为有机染料分子(Gelred)和溴化乙锭(Ethidiumbromide，EB)。优选Gelred。所述的竞争性结合剂为肝素钠或血清。优选的，所述竞争性结合剂浓度为0.02～0.16μg/μL。所述步骤(3)中肿瘤细胞为人喉癌细胞(Hep-2)、人宫颈癌细胞(Hela)、人大肺癌细胞(NCI-H460)及人非小肺癌细胞(A549)。本专利技术与现有技术相比，具有下列优点：1.本专利技术从宏观时间及秒级时间内分析阳离子脂质体与基因的解离过程，并定量的分析阳离子脂质体解离基因的情况。现有技术只是从阳离子脂质体与基因结合过程中复合物尺寸的变化，颗粒的聚集情况考察阳离子脂质体与基因的结合过程，而阳离子脂质体与基因的结合作用比较复杂，其结合情况是阳离子脂质体介导基因高效递送的关键，阳离子脂质体与基因结合得太疏松，基因可能会在血液中提前释放而无法到达靶部位；两者结合得过于紧密又不利于基因与阳离子脂质体发生解离，影响基因在细胞内释放，从而影响其递送效率。运用本专利技术可以对阳离子脂质体介导基因递送的机制进行深入分析。将细胞制成超薄切片，通过透射电子显微镜技术更清晰的示踪脂质体/基因复合物在细胞内的基因释放过程。2.目前，凝胶电泳技术和荧光光谱技术还没有运用到解离动力学研究领域。本专利技术可以实现将凝胶电泳技术和荧光光谱技术应用于阳离子脂质体与基因解离动力学方面的研究。从宏观时间下测定阳离子脂质体与基因的解离过程。同时，与停流光谱技术结合使用，停流光谱技术是一种研究快速反应动力学的实验技术，可在数毫秒内检测到量物质的解离情况，该技术操作简便、灵敏度高，进一步测定阳离子脂质体与基因在秒级内的解离情况，为精准测量阳离子脂质体与基因的解离奠定了技术基础。本专利技术可以在宏观时间及微观时间下测定阳离子脂质体/基因复合物的解离过程，并精确定量测定了基因从复合物中的释放量。优化选出符合人体含量要求的肝素钠溶液浓度为0.1μg/μL使基因从复合物中解离，发现0-70min内，随着解离时间的延长，游离的基因的量也逐渐增多，从0逐渐增大到83.86％，从40min开始达到解离平衡；将阳离子脂质体与基因结本文档来自技高网...

【技术保护点】
阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)阳离子脂质体与基因按照质量比6：1～1：1制备阳离子脂质体/基因复合物，加入浓度为0.02‑2μg/μL竞争性结合剂与基因竞争性结合阳离子脂质体，使基因从复合物中释放，采用琼脂糖凝胶电泳检测阳离子脂质体/基因复合物解离0～48h基因从复合物中的释放情况，采用凝胶成像系统软件定量分析阳离子脂质体解离基因的量；(2)根据步骤(1)制备阳离子脂质体/基因复合物，加入荧光染料与阳离子脂质体竞争性结合基因，建立荧光共振能量转移体系，使基因从复合物中解离，荧光染料与基因的质量比1:1～24:1，解离0～48h，采用荧光光谱测量基因从复合物释放不同时间后的发光强度；采用停流光谱仪检测0‑200s内基因从复合物中瞬时释放动力学，得到解离动力学曲线，通过停流光谱仪分析软件进行线性拟合，得到结合动力学轨迹符合线性方程；y＝0.1027ln(x)+0.9015；(3)利用透射电子显微镜检测阳离子脂质体/基因复合物的细胞内解离过程：培养肿瘤细胞种植于6孔细胞培养板中，使其在转染日细胞密度达80～90％；根据步骤(1)制备阳离子脂质体/基因复合物，加到细胞培养板中，培育0h～96h，将肿瘤细胞制成细胞悬液，加入戊二醛固定24h，经树脂包埋后进行细胞超薄切片，再经醋酸双氧铀染色后，在透射电镜下观察基因在肿瘤细胞内的释放情况，透射电镜加速电压为100kV。...

【技术特征摘要】
1.阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)阳离子脂质体与基因按照质量比6：1～1：1制备阳离子脂质体/基因复合物，加入浓度为0.02-2μg/μL竞争性结合剂与基因竞争性结合阳离子脂质体，使基因从复合物中释放，采用琼脂糖凝胶电泳检测阳离子脂质体/基因复合物解离0～48h基因从复合物中的释放情况，采用凝胶成像系统软件定量分析阳离子脂质体解离基因的量；(2)根据步骤(1)制备阳离子脂质体/基因复合物，加入荧光染料与阳离子脂质体竞争性结合基因，建立荧光共振能量转移体系，使基因从复合物中解离，荧光染料与基因的质量比1:1～24:1，解离0～48h，采用荧光光谱测量基因从复合物释放不同时间后的发光强度；采用停流光谱仪检测0-200s内基因从复合物中瞬时释放动力学，得到解离动力学曲线，通过停流光谱仪分析软件进行线性拟合，得到结合动力学轨迹符合线性方程；y＝0.1027ln(x)+0.9015；(3)利用透射电子显微镜检测阳离子脂质体/基因复合物的细胞内解离过程：培养肿瘤细胞种植于6孔细胞培养板中，使其在转染日细胞密度达80～90％；根据步骤(1)制备阳离子脂质体/基因复合物，加到细胞培养板中，培育0h～96h，将肿瘤细胞制成细胞悬液，加入戊二醛固定24h，经树脂包埋后进行细胞超薄切片，再经醋酸双氧铀染色后，在透射电镜下观察基因在肿瘤细胞内的释放情况，透射电镜加速电压为100kV...

【专利技术属性】
技术研发人员：张树彪，赵轶男，朴永哲，海华，许晓东，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21